PCR预混液及其在检测粪便样本中核酸的应用的制作方法

pcr预混液及其在检测粪便样本中核酸的应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种pcr预混液及其在检测粪便样本中核酸的应用。


背景技术：

2.粪便是来自动物消化道的食物渣滓，在临床上通常采集粪便样本来检测寄生虫或病原性微生物。近年来，随着精准医疗的开展，粪便样本的诊断价值逐步上升。目前比较常见的是使用粪便样本检测胃肠道微生物的情况。随着时间发展，胃肠道微生物群体会受到多种影响，例如：个体基因差异、年龄、性别、营养、抗生素或其它药物、身体状况、生活方式等。
3.通常采用核酸检测的方式对粪便样本中的核酸进行检测。由于粪便中的核酸来源复杂种类繁多，特别是粪便中含有大量的消化残留物和微生物，导致核酸非常容易分解，因此粪便中的有效核酸含量极少。极大的增加了粪便样本中核酸的检测难度。
4.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，h.pylori)生存于人体胃部，是最常见的细菌病原体之一，世界有多半人口受到过幽门螺杆菌的感染。自从幽门螺杆菌(hp)发现20多年来，与hp密切相关的胃肠道疾病包括：活动性胃炎、消化性溃疡病、胃癌、胃粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤等。目前估计全球约有50％的人感染hp。1994年，世界卫生组织已经将hp列为第i类致癌因子。
5.目前对幽门螺杆菌诊断较为准确的方法有13c/14c呼气试验和胃粘膜组织活检。但c13/14呼气试验具有放射性，对人体有害；而胃粘膜组织活检不易取材。有研究报道幽门螺杆菌可随粪便少量的排出体外，实验人员通常希望从粪便中检测幽门螺杆菌，从而达到诊断目的，但粪便中幽门螺杆菌含量极低，同时粪便中存在大量抑制物且其他的杂菌含量很高，因此在做pcr检测的时候很难将幽门螺杆菌检测到。
6.因此，本领域迫切需要开发一种能够在有效检测粪便样本中低含量核酸的技术，以满足临床的检测需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种pcr预混液及其在检测粪便样本中核酸的应用。
8.本发明的第一方面，提供了一种pcr预混液，所述pcr预混液含有3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸。
9.在另一优选例中，所述pcr预混液还含有氧化型谷胱甘肽。
10.在另一优选例中，所述pcr预混液还含有(nh4)2so4。
11.在另一优选例中，所述pcr预混液还含有dmso。
12.在另一优选例中，所述pcr预混液包含选自下组的一个或多个组分：3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽。
13.在另一优选例中，所述pcr预混液包含：3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧
化型谷胱甘肽。
14.在另一优选例中，所述pcr预混液还含有选自下组的一种或多种组分：
15.tris
‑
hcl、kcl、和mgcl2。
16.在另一优选例中，使用所述pcr预混液进行pcr扩增时，pcr扩增体系中3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸的终浓度为5mm
‑
15mm，优选为10mm。
17.在另一优选例中，使用所述pcr预混液进行pcr扩增时，pcr扩增体系中(nh4)2so4终浓度为5mm
‑
10mm，优选为7.5mm。
18.在另一优选例中，使用所述pcr预混液进行pcr扩增时，pcr扩增体系中dmso终浓度为1％
‑
3％(w/v)，优选为2％。
19.在另一优选例中，使用所述pcr预混液进行pcr扩增时，pcr扩增体系中氧化型谷胱甘肽终浓度为1mm
‑
3mm，优选为2mm。
20.本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述的pcr预混液的用途，用于制备pcr检测试剂盒。
21.在另一优选例中，所述pcr检测试剂盒用于检测粪便样本中的核酸。
22.在另一优选例中，所述粪便来源于人或非人哺乳动物。
23.在另一优选例中，所述核酸包括微生物来源的核酸或者人体脱落细胞(如白细胞)基因组dna。
24.本发明的第三方面提供了一种pcr检测试剂盒，所述pcr检测试剂盒包括本发明第一方面所述的pcr预混液。
25.在另一优选例中，所述试剂盒还包括引物探针混合液。
26.在另一优选例中，所述引物探针混合液特异性检测幽门螺杆菌核酸。
27.在另一优选例中，所述引物探针混合液中包括：
28.seq id no.:1所示的上游引物序列、seq id no.:2所示的下游引物序列和seq id no.:3所示的探针序列。
29.本发明的第四方面提供了一种pcr检测方法，所述方法包括步骤：
30.(1)配置pcr检测体系；和
31.(2)pcr扩增；
32.其中，所述pcr检测体系包括目的核酸、靶向目的核酸的pcr扩增引物和选自下组的一个或多个组分：3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽。
33.在另一优选例中，所述pcr检测体系还包括选自下组的一个或多个组分：tris
‑
hcl、kcl、mgcl2、dntp、和taq酶。
34.在另一优选例中，所述目的核酸来自粪便样本。
35.在另一优选例中，所述目的核酸为幽门螺杆菌核酸。
36.在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的，例如可以使用本发明的方法对粪便污染的环境样本进行检测，检测结果信息供公共卫生的管理监测使用。
37.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
38.图1显示了pcr检测反应液1和pcr检测反应液2对提取的幽门阳性患者粪便的检测曲线；
39.图2显示了pcr检测反应液1和pcr检测反应液3对配制的1copy/10μl浓度的粪便样本的检测曲线；
40.图3显示了pcr检测反应液4对配制的1copy/10μl浓度的粪便样本的检测曲线；
41.图4显示了各pcr检测反应液对提取的幽门阴性患者粪便的典型检测曲线。
具体实施方式
42.本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量测试，意外地发现在基本pcr反应体系里面添加3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽，可以降低粪便中的多糖抑制物对dna聚合酶的抑制，同时也可以消除其它杂菌对pcr扩增的干扰，因此极大的提高了从粪便样本中检测出低含量核酸的成功率。在此基础上，本发明人完成了本发明。
43.样本
44.如本文所用，术语“样本”、“标本”可互换使用。在本发明中，所述样本的来源没有特别限制，可以由生物体采集，在一优选例中，所述“样本”来自粪便样本。并且，采集样本的方法没有特别限制，可以采用常规方法进行采集。
45.pcr预混液
46.本发明提供了一种pcr预混液，可以用于粪便样本中低含量核酸的检测。本发明的pcr预混液含有选自下组的一种或多种组分：3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽。
47.在一个优选地实施方式中，该pcr预混液包含3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸。
48.在一个优选地实施方式中，该pcr预混液包含(nh4)2so4。
49.在一个优选地实施方式中，该pcr预混液包含dmso。
50.在一个优选地实施方式中，该pcr预混液包含氧化型谷胱甘肽。
51.在一个优选地实施方式中，该pcr预混液包含3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽这四种组分中的至少两种，优选地至少三种，最优选地至少四种组分。
52.在本发明的一个优选地实施方式中，在基本pcr反应体系(例如：tris
‑
hcl10mm ph8.3、kcl 50mm、mgcl
2 1.5mm)里面添加有3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽可获得本发明的pcr预混液。
53.本发明的pcr预混液中，3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4和dmso主要是作用于dna聚合酶的结构。由于dna聚合酶通常与6
‑
8个碱基对相结合，当不含有3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4和dmso时6
‑
8个碱基中含有碱基错配，dna聚合酶依然可以工作。但当含有3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4和dmso时6
‑
8个碱基中含有碱基错配，dna聚合酶完全不能工作，从而减少了非特异性扩增的产生。
54.另外，粪便中对pcr反应的主要抑制物为多糖类物质，氧化型谷胱甘肽可以降低多糖抑制物对dna聚合酶的抑制，减少多糖类物质与dna聚合酶结合，增加酶的活性。本发明发现，氧化型谷胱甘肽的效果要比bsa(牛血清白蛋白)好上数倍。
55.优选的，pcr反应体系中，所述3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸终浓度为5mm
‑
15mm，更优选为10mm的终浓度。所述(nh4)2so4终浓度为5mm
‑
10mm，更优选为7.5mm的终浓度。所述dmso终浓度为1％
‑
3％(w/v)，更优选为2％的终浓度。所述氧化型谷胱甘肽终浓度为1mm
‑
3mm，更优选为2mm的终浓度。
56.粪便样本核酸检测试剂盒
57.本发明还提供了一种用于粪便样本核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括选自下组的一种或多种组分：3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸、(nh4)2so4、dmso和氧化型谷胱甘肽。上述各组分，可以各自包装于独立的容器；也可以任选地两种组分、任选地三种组分、或者四种组分混合包装于一个容器。
58.在本发明的一个优选地实施方式中，所述试剂盒还包括常规的用于pcr反应的试剂，例如：tris
‑
hcl、kcl、mgcl2、dntp、和taq酶。这些试剂可以包装于独立的容器，也可以以混合液的形式包装。
59.在本发明中，本发明的试剂盒中的各个组分之间的比例，以及各个组分的含量可以不受特别限制。
60.本发明的试剂盒中的各组分可购买获得，或用常规方法制备。
61.在本发明中，所述试剂盒的各个组分可分别位于不同容器中或位于同一容器中。
62.可以使用本发明的试剂盒对粪便样本中的核酸进行检测，例如，可以检测粪便中的幽门螺杆菌。
63.在本发明的一个优选地实施方式中，用于检测粪便中幽门螺杆菌的的引物序列为seq id no.1：5
’‑
agatgggagctgtctcaaccagag
‑3’
，seq id no.2：5
’‑
aagcccttacttcaaagcctcccac
‑
3。检测探针序列为seq id no.3：5
’‑
fam
‑
agcactgctaatgggaatatcatgcgc
‑
bhq1
‑
3。
64.优选的，所述引物在pcr反应体系中的浓度为100nm
‑
400nm，所述探针在pcr反应体系中的浓度为200nm
‑
400nm。
65.本发明的主要优点包括：
66.(1)使用本发明的pcr预混液液对粪便样本中的核酸进行检测，具有极高的灵敏度，能够检测出粪便样本中含量极低的目的核酸。
67.(2)使用本发明的pcr预混液、试剂盒进行pcr检测，可以消除其它杂菌对目的核酸扩增的干扰，能够显著减少非特异性扩增的产生。
68.(3)使用本发明的pcr预混液液制备pcr反应体系，能够降低多糖抑制物对dna聚合酶的抑制，减少多糖类物质与dna聚合酶结合，增加酶的活性。因此，能够显著提高检测的灵敏度。
69.(4)使用本发明的试剂盒和检测方法对粪便中的幽门螺杆菌进行特异性检测，可以从抑制物很多且杂菌含量很高的粪便样本中检测到低至1拷贝的幽门螺杆菌基因。
70.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
71.本发明所用的材料和试剂如无特别说明，均为市售产品。例如粪便dna提取试剂盒
可以使用qiagen粪便dna快速提取试剂盒(qiaamp fast dna stool mini kit)。taq酶可以购自赛默飞公司。
72.实施例1
73.配制本发明的粪便幽门螺杆菌荧光pcr检测反应液1，和改良前的荧光pcr检测反应液2。配制方法如表1。
74.用商品化的粪便dna提取试剂盒提取幽门阳性患者的粪便。对提取的粪便模板进行检测。
75.表1.pcr检测反应体系的配制
[0076][0077]
将配制好的pcr检测反应液1和pcr检测反应液2进行荧光pcr反应，程序为95℃10min，95℃15s，60℃1min，45个循环。
[0078]
结果如图1所示，对比pcr检测反应液1和pcr检测反应液2的荧光扩增曲线可以看出，pcr检测反应液1检测到了幽门螺杆菌，pcr检测反应液2没有检测到幽门螺杆菌。
[0079]
实施例2
[0080]
配制本发明的粪便幽门螺杆菌荧光pcr检测反应液1，和a公司的商品化的pcr检测反应液3，与b公司的商品化的pcr检测反应液4。配制方法如表2：
[0081]
用商品化的粪便dna提取试剂盒提取幽门阴性患者的粪便。在提取好的粪便dna中加入幽门螺杆菌的基因组dna，使得粪便dna中幽门基因组的含量为1copy/10μl。对配制好的粪便模板进行多批次检测验证。
[0082]
表2.pcr检测反应体系的配制
[0083][0084][0085]
将配制好的pcr检测反应液1和pcr检测反应液3进行荧光pcr反应，程序为95℃10min，95℃15s，60℃1min，45个循环。
[0086]
典型结果如图2所示，对比pcr检测反应液1和pcr检测反应液3的荧光扩增曲线可以看出，pcr检测反应液1检测到了幽门螺杆菌，pcr检测反应液3没有检测到幽门螺杆菌。
[0087]
将配制好的pcr检测反应液4进行荧光pcr反应，程序为98℃30s，98℃10s，60℃1min，45个循环。
[0088]
典型结果如图3所示，可以看出pcr检测反应液4没有检测到幽门螺杆菌。
[0089]
实施例3
[0090]
按照实施例1的pcr检测反应液1和pcr检测反应液2，a公司的商品化的pcr检测反应液3，b公司的商品化的pcr检测反应液4，配制pcr检测体系(参考表2)。用商品化的粪便dna提取试剂盒提取幽门阴性患者的粪便，制得阴性粪便模板。分别使用上述pcr检测反应液1、pcr检测反应液2、pcr检测反应液3、pcr检测反应液4配制的pcr检测体系对50例阴性粪便模板进行检测。
[0091]
pcr检测程序为95℃10min，95℃15s，60℃1min，45个循环。
[0092]
检测结果表明，使用pcr检测反应液1检测的50例阴性粪便模板的检测结果均为阴性；使用pcr检测反应液2检测的50例阴性粪便模板的检测结果中，有4例样本在扩增后期出现了扩增曲线；使用pcr检测反应液3检测的50例阴性粪便模板的检测结果中，有2例样本在扩增后期出现了扩增曲线；使用pcr检测反应液4检测的50例阴性粪便模板的检测结果中，有3例样本在扩增后期出现了扩增曲线。
[0093]
典型检测结果如图4所示，说明使用本发明的pcr检测反应液1进行粪便样本检测，能够显著降低非特异性扩增的产生，进而能够避免假阳性结果。而pcr检测反应液2
‑
4对杂菌核酸的抗干扰能力较弱，容易出现假阳性结果。
[0094]
综上实施例可以看出，本发明可以检测出粪便中极低含量的幽门螺杆菌，而对阴性的粪便样本不会造成假阳性结果。
[0095]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。