一种冠状病毒致弱突变株及其制备方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冠状病毒致弱突变株及其制备方法和应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。系统进化分析表明，sars-cov-2是一种不同于sars-cov和mers-cov的新型冠状病毒。到目前为止，中华菊头蝠体内的冠状病毒ratg13与sars-cov-2全基因组序列同源性最高，为96.2％。除剌突基因外，小菊头蝠病毒rpyn06在大部分基因组中与sars-cov-2的亲缘关系最近。此外，在广东省和广西省查获的境外走私穿山甲样品中也发现了多种冠状病毒，已鉴定出的2种穿山甲冠状病毒gd/2019和gx/2017与sars-cov-2基因组序列具有高度的同源性(85.5％-92.4％)【1、2】。特别是gd/2019的受体结合域(rbd)与sars-cov-2的rbd氨基酸序列相似性高达97.4％，gx/2017rbd与sars-cov-2rbd的氨基酸序列同源性为86.8％。研究表明，gx/2017棘突蛋白与人类ace2结合并入侵宿主细胞的能力与sars-cov-2棘突蛋白相当【3】。此外，发明人团队前期对穿山甲冠状病毒gx/p2v近乎完整的基因组序列进行了分析(genbank登录号mt072864)，结果显示穿山甲冠状病毒gx/p2v基因组有29,795个核苷酸，其中包括10个不确定的核苷酸和2个未知的末端。gx/p2v与穿山甲gx/2017其他5个分离株的基因组序列均具有很高的相似性(99.83～99.92％)，与sars-cov-2的棘突蛋白同源性达92.5％，是迄今为止成功分离到的与sars-cov-2棘突蛋白同源性最高的病毒【1】。该gx/p2v序列是从第一次传代的样品(穿山甲小肠-肺混合样)中获得的，而不是连续传代的分离株。
3.sars-cov-2的传染性强，传播范围广，严重危害了全球的公共卫生安全，亟待有效的防控措施。因此，研发特异性治疗药物及安全有效的疫苗成为全球应急科研攻关的重要任务，然而，鉴于sars-cov-2活病毒操作的危险性，只能在生物安全三级(bsl-3)及以上的实验室培养，极大的限制了相关研究的开展。因此，分离出类似sars-cov-2的冠状病毒致弱株且可在bsl-2实验室常规培养的毒株，不仅能降低实验室成本和实验室要求，同时也为快速、安全地进行药物筛选、疫苗研发以及sars-cov-2感染分子机制等相关研究提供有力的工具。


技术实现要素：

4.为克服现有技术中的问题，本发明提供了一种冠状病毒致弱突变株以及一种冠状病毒的减毒方法，通过对gx/p2v进行了8次连续传代培养，考虑到rna病毒的多变性，进行了全基因组序列分析(genbank登录号mw532698)，并命名为gx_p2v分离株。所述冠状病毒致弱突变株在体外和体内感染模型中都具有高度的减毒作用，可用于筛选对抗冠状病毒(尤其是新型冠状病毒)的药物以及疫苗的研发。
5.本发明提供了一种冠状病毒致弱突变株，所述冠状病毒致弱突变株是发生了冠状
病毒3'末端非翻译区(3'-utr)高变区(hvr)的核苷酸缺失。
6.在本发明的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株与穿山甲冠状病毒gx/p2v的基因序列(genbank登录号mt072864)相比，该突变株的3'末端非翻译区(3'-utr)的高变区(hvr)缺失了104个核苷酸，缺失范围位于mt072864的第29,617至29,720位核苷酸。
7.在本发明的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株还包含单核苷酸突变，导致核蛋白的最后一位氨基酸ala变为val。
8.在本发明的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株gx_p2v分离株的全基因组核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示。
9.在本发明的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株gx_p2v分离株于2021年7月23日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc no.23082。
10.本发明还提供了一种冠状病毒的减毒方法，其包括以下步骤：使冠状病毒基因组3'末端非翻译区(3'-utr)的高变区(hvr)核苷酸缺失，与genbank登录号mt072864的穿山甲冠状病毒gx/p2v的基因组3'末端非翻译区(3'-utr)的高变区(hvr)相比，优选为104个核苷酸缺失。
11.在本发明的一个实施方案中，所述减毒方法还包括以下步骤：使核蛋白的最后一位氨基酸ala置换为val。
12.本发明还提供通过上述减毒方法获得的冠状病毒致弱突变株。
13.本发明还提供上述冠状病毒致弱突变株或者通过上述减毒方法获得的冠状病毒致弱突变株的应用，其用于抗冠状病毒(包括但不限于sars-cov-2病毒)活性药物的筛选与评价，抗冠状病毒(包括但不限于sars-cov-2病毒)疫苗的筛选与评价，以及用于抗冠状病毒(包括但不限于sars-cov-2病毒)减毒疫苗或灭活疫苗的制备，以及用于冠状病毒(包括但不限于sars-cov-2病毒)诊断和治疗性抗体的制备。其中所述疫苗中还包括药学上可接受的佐剂。
14.本发明还提供一种用于筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的药物筛选模型，其包括上述冠状病毒致弱突变株或通过上述减毒方法获得的冠状病毒致弱突变株。
15.根据本发明的药物筛选模型，其中采用所述穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株感染的哺乳动物细胞，优选vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。
16.根据本发明的药物筛选模型，其中采用所述穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株感染的哺乳动物，优选叙利亚金黄仓鼠。
17.根据本发明的药物筛选模型，其中所述模型优选用于筛选和/或评价抗sars-cov-2病毒活性的药物。
18.本发明还提供一种筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，采用上述药物筛选模型进行；该方法优选用于筛选和/或评价抗sars-cov-2病毒)活性的药物。
19.根据本发明中筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，其包括步骤(1)：向所述药物筛选模型中加入待测试的药物并进行培养；
20.在步骤(1)之后还任选地包括以下步骤(2a)或步骤(2b)，或同时包含步骤(2a)和步骤(2b)：
21.步骤(2a)：在显微镜下观察细胞病变；
22.步骤(2b)：测定细胞和上清中的病毒核酸。
23.根据本发明中筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，步骤(1)中的培养时间可以为12-90小时，；进一步优选地，为24-72小时，48-72小时；具体为，24小时，48小时或72小时。
24.在步骤(2a)中，当观察到存在完整的细胞单层或细胞病变不明显时，表明待测试的药物具有抑制病毒复制的活性。
25.有益效果
26.本发明分离到将穿山甲冠状病毒gx/p2v体外培养第八代的穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株，确定了其完整基因组，并鉴定了两种新型的细胞培养适应性突变：核蛋白基因最后一位氨基酸密码子中的一个非同义突变和hvr区部分核苷酸的的自发性缺失。该gx_p2v分离株在体内外培养时均表现出高度减毒的特点。在此基础上，发明人开发了冠状病毒的减毒方法，并构建了冠状病毒减毒株。所构建的gx_p2v分离株减毒株，可在bsl-2实验室常规培养，可替代sars-cov-2作为一种模型，该模型可用于抗冠状病毒(包括但不限于sars-cov-2病毒)药物和疫苗的筛选，安全可靠。
27.生物保藏说明
28.gx_p2v分离株(也称为“穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株”、pangolin coronavirus gx_p2v isolate)，于2021年7月23日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏机构简称：cgmcc，保藏编号为cgmcc no.23082。
附图说明
29.图1为sars-cov-2、gx/p2v原始样品和gx/p2v体外培养第八代的gx_p2v分离株之间的序列比较；
30.穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株的n蛋白基因的3’末端发生了两种突变导致核蛋白的最后一位氨基酸ala置换为val和3'-utr中hvr区的104个核苷酸缺失。
31.(a)核蛋白基因3'末端序列的比对。(b)部分3'-utr序列的比对。“点”代表与sars-cov-2相同的碱基，“连字符”代表核苷酸的缺失。
32.图2为穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株在非人灵长类细胞中的生长特性；
33.(a)gx_p2v分离株感染bgm和vero细胞后的细胞病变效应，连续监测5天。比例尺：100μm。(b)用感染了gx_p2v分离株的叙利亚金黄仓鼠血清，通过免疫荧光法检测病毒蛋白。细胞核用dapi染色。比例尺：50μm。(c)gx_p2v分离株感染bgm和vero细胞，病毒空斑显示小斑块表型。“小白点”代表斑块。(d)测量斑块的平均直径。与bgm相比，vero显示出相对较大的斑块(p《0.0001)。p值采用不配对双尾student's t检验计算。数据以平均值
±
sds表示。
34.图3为gx_p2v分离株在bgm细胞(实线)和vero细胞(虚线)中的复制动力学；
35.(a)采用qrt-pcr测定病毒rna拷贝数。(b)采用tcid
50
标准滴定法测定病毒滴度。p值采用不配对双尾student's t检验(***p《0.001)。
36.图4为gx_p2v分离株鼻内攻毒后仓鼠的临床特征和肉眼观病理病变；
37.(a)对gx_p2v分离株感染组(1
×
105tcid
50
)叙利亚金黄仓鼠和对照组叙利亚金黄仓鼠定期记录体重变化；各点数据显示了与第0天相比体重变化的百分比和平均值。同时，
对观察期2周的临床症状进行评分；各数据点表示累积的临床评分和平均值。(b)留取对照组和gx_p2v分离株感染组叙利亚金黄仓鼠(1
×
104或1
×
105tcid
50
)的肺和气管组织，肉眼观察组织表面病理改变。
38.图5为gx_p2v分离株在仓鼠体内的复制特点；
39.(a)和(b)采用qrt-pcr方法检测gx_p2v分离株攻毒后叙利亚金黄仓鼠肺和气管组织在感染后第2、5、7和14天的病毒载量(n＝3只/天)。(c)和(d)采用tcid
50
法测定gx_p2v分离株攻毒后叙利亚金黄仓鼠肺和气管组织在感染后第2、5、7和14天的病毒滴度(n＝3只/天)。各图中虚线表示检测极限。
40.图6为gx_p2v分离株感染后叙利亚金黄仓鼠肺和气管组织的病理学变化；
41.(a)低剂量感染组(1
×
104tcid
50
)与对照组相比，感染叙利亚金黄仓鼠肺部未见明显病理损伤。(b)高剂量感染组(1
×
105tcid
50
)肺部无严重组织病变，仅在感染后第5天出现少量炎症细胞浸润，血管周围有少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润。与对照组相比，不管是低剂量组还是高剂量组，在感染的整个过程中，气管均未见组织学改变。图中h&e 400
×
为h&e 100
×
方框区域的放大图(n＝3)。
具体实施方式
42.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
43.实施例1.获得穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株的完整基因组序列
44.发明人团队前期对来源于穿山甲样品的冠状病毒gx/p2v近乎完整的基因组已在《自然》杂志上进行了描述(genbank登录号mt072864)【1】。gx/p2v基因组有29,795个核苷酸，其中包括10个不确定的核苷酸和2个未知的末端。该序列是从gx/p2v样品(穿山甲小肠-肺混合样品)中获得的，而不是连续传代的分离株。考虑到这种穿山甲冠状病毒与sars-cov-2的遗传相关性，发明人试图确定gx_p2v分离株的完整基因组，希望它有助于理解sars-cov-2和相关病毒的进化。
45.材料和方法
46.1、病毒培养：vero e6细胞(美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)用含有高葡萄糖的dulbecco改良eagle培养基培养，该培养基中添加了10％的胎牛血清。穿山甲冠状病毒gx/p2v是于2017年从走私的死亡的穿山甲体内分离出来的【1】。
47.2、测序：通过超速离心从vero e6细胞培养上清液中纯化穿山甲冠状病毒gx/p2v第八代分离株，即gx_p2v分离株。用axyprep
tm
体液病毒dna/rna小量制备试剂盒(axygen，目录号ap-mn-bf-vna-250，浙江杭州)提取总rna。通过二代测序(ngs)方法进行全基因组测序。用truseq rna文库制备试剂盒(illumina)构建cdna文库，并用illumina miseq系统进行测序。序列数据已保存在中国微生物数据中心(项目登录号为nmdc10017729，序列登录号为nmdc40002427)。
48.3、冠状病毒基因组的组装和表征：先用fastp程序对原始读数进行数据质控。再用bowtie 2序列比对软件将原始的测序读数与穿山甲冠状病毒gx/p2v(genbank登录号mt072864)近乎完整的基因组进行对比。然后使用trinity组装软件对映射到gx/p2v基因组
的读段重新组装，使组装的重叠群具有完整的3'末端。用5'/3'race试剂盒(takara)确定病毒基因组的5'末端。最后用clustalw对gx_p2v分离株和gx/p2v样品的病毒基因组序列进行比对，以期发现gx_p2v分离株的新型突变。
49.实验结果
50.从穿山甲冠状病毒gx/p2v体外培养的第八代穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株样本中提取总rna，并使用illumina miniseq进行双端测序，从而构建出宏转录组文库。测序结果显示共产生了8,482,736个读取序列。序列比对和重新组装后获得了gx_p2v分离株的基因组，结果显示，该病毒基因组重叠群共有29,718个核苷酸，3'端含有八个连续的腺嘌呤碱基。最后，该病毒被命名为gx_p2v分离株，gx_p2v分离株全基因组序列(29,729nt)的genbank登录号为mw532698。
51.接下来，发明人比较了gx/p2v样本和第八代gx_p2v分离株之间的序列差异。gx/p2v样本的序列具有完整的5'或3'末端序列，与gx/p2v相比，第八代gx_p2v分离株有两个突变：核蛋白基因的非同义突变(gcu
→
guu)和3'末端非翻译区(3'-utr)的高变区(hvr)104个核苷酸缺失(图1)。单核苷酸突变导致核蛋白的最后一位氨基酸上ala变为val。然后，发明人检查了gx/p2v样本的第一代是否也有这两个突变，在gx/p2v样本的测序读段(srr11093271)中，只有一个读段出现了单核苷酸突变，而所有读段均未发生hvr区的104个核苷酸缺失。相比之下，在传代分离株的测序读段中，覆盖这两个突变区的所有读段均包含已鉴定的突变。这些数据表明，这两个区域在细胞培养物中具有很强的选择压力。
52.根据当前的3'-utr模型【4】，gx/p2v样本的hvr区域长166nt，根据提交的序列(genbank登录号mt072864)，范围从29,611到29,776。缺失范围为29,617至29720，占整个hvr区的62.7％。在所有冠状病毒临床样本中，hvr区域均未见此突变。因此，第八代细胞培养的gx_p2v分离株的hvr区域自发删除属于首次报告。
53.实施例2.穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株在非人灵长类细胞中持续生长，产生轻度细胞损伤和小斑块
54.材料和方法
55.1、病毒和细胞：gx/p2v冠状病毒来源于2017年缉私行动中捕获的穿山甲(genbank登录号mt072864)的肺和肠混合样本，在vero e6细胞中连续传代八次。收集细胞上清，10000
×
g离心5min，-80℃保存病毒。采用tcid
50
试验或空斑形成单位方法确定病毒滴度。bgm和vero细胞来源于美国马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心，用rpmi 1640培养基(gibco,usa)，培养基中添加10％胎牛血清(fbs)(gibco,usa)和100单位/毫升青霉素-链球菌(gibco,usa)，放置37℃，5％co2培养箱中培养。本发明所有涉及感染性病毒的实验均在bsl-2实验室进行。
56.2、病毒空斑实验和细胞病变效应：采用甲基纤维素-结晶紫空斑法进行空斑试验，以确定空斑表型和感染性病毒滴度。将bgm和vero细胞接种于6孔板，形成单层细胞后，分别将10-1
至10-6
连续10倍稀释的gx_p2v分离株感染单层细胞，在37℃下连续孵育2小时，每15分钟轻轻摇晃一次。病毒吸附后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤2次，之后加入含有2％fbs、1％甲基纤维素和hepes(20mm)的mem培养基，并放置37℃，5％co2培养箱培养。在显微镜下观察细胞病变效应，并连续拍照5天。感染后第5天，细胞在室温下用4％多聚甲醛固定2小时，然后用0.2％结晶紫染色20分钟，在自来水下轻轻冲洗，待干燥后分析空斑表型并计
算病毒滴度。
57.3、tcid
50
实验：将96孔板中的bgm细胞(2.5
×
104个细胞/孔)与10倍连续稀释的gx_p2v分离株细胞培养上清或组织匀浆充分混匀后，放置37℃，5％co2培养箱中孵育。感染后第5天，显微镜下观察细胞病变效应，计算病毒滴度，以tcid
50
/ml表示。
58.4、rna提取和qpcr分析：使用病毒dna/rna提取试剂盒(全式金，目录号er201-01，北京，中国)从细胞培养上清中提取总病毒rna。采用第一链cdna合成试剂盒(翌圣，目录号11123es60，上海，中国)进行反转录，并利用fastfire qpcr premix(探针)(天根，目录号fp208-02，北京，中国)进行qpcr扩增gx_p2v分离株n基因。qrt-pcr引物序列如下:
59.p2vf：tcttcctgctgcagatttggat；
60.p2vr：attctgcacaagagtagactatgtatcgt；
61.探针：fam-tgcagaccacacaaggcagatgggc-tamra。
62.此外，构建标准质粒：将p2vf和p2vr扩增的片段插入克隆载体peasy-t1(全式金，目录号ct101-01，北京，中国)，构建质粒标准品。
63.5、病毒生长动力学：以moi为0.01的gx_p2v分离株感染6孔板中的bgm或vero单层细胞，放置37℃、5％co2培养箱中孵育2小时，然后用pbs洗两次，加入含有2％fbs和hepes(20mm)的rmpi 1640培养基。在指定的时间点收集培养上清，-80℃保存，通过qpcr和tcid
50
分别定量检测病毒rna拷贝数和病毒滴度，用于后续的病毒生长动力学检测。
64.6、免疫荧光实验：以moi为0.01的gx_p2v分离株感染12孔板中的bgm单层细胞，在37℃、5％co2培养箱中孵育2小时，然后用pbs洗两次，加入培养基。在指定的时间节点，pbs洗涤细胞2次，用4％多聚甲醛室温固定20分钟，0.2％曲拉通x-100细胞破膜10分钟，然后用3％牛血清白蛋白4℃封闭过夜。gx_p2v分离株感染仓鼠后的血清作为一抗，室温下孵育2小时。pbs洗涤5次后，用荧光素fitc标记的山羊抗小鼠igg(1:300，中杉金桥，目录号zf-0312，北京，中国)二抗孵育1小时。pbs洗涤5次后，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)(sigma,目录号10236276001，德国)染色20分钟。最后，洗涤5次后，使用荧光显微镜扫描覆盖细胞并拍照。
65.统计分析
66.采用graphpad prism 9.0版软件进行分析。两组间的差异采用双尾student t检验进行分析。p值小于0.05(p《0.05)认为有统计学意义。
67.实验结果
68.1、穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株在非人灵长类细胞中持续生长，产生轻度细胞损伤和小斑块
69.用moi为0.01的gx_p2v分离株感染bgm和vero细胞。gx_p2v分离株感染后，vero和bgm细胞产生了相似的细胞病变效应(图2a)。感染后24小时，未见明显的细胞变性。感染后48小时开始出现明显的细胞变性和细胞变圆。感染后72小时细胞开始裂解和部分脱落。细胞病变效应与病毒复制直接相关，免疫荧光也证实了gx_p2v分离株感染细胞的特点(图2b)。与观察到的gx_p2v分离株引起细胞缓慢损伤的特点相一致，gx_p2v分离株只能在感染后第5天产生小斑块(图2c和2d)。相比之下，sars-cov-2可在感染后第2天导致vero细胞大量损伤，并形成大斑块【5、6】。显然，与sars-cov-2相比，gx_p2v分离株在引起细胞损伤和斑
块形成方面毒力有所减弱。
70.2、分别用qpcr和病毒滴定法定量测定gx_p2v分离株感染bgm和vero细胞培养上清中的病毒rna拷贝和病毒滴度，从而获得gx_p2v分离株在bgm和vero细胞的生长动力学。
71.moi为0.01的gx_p2v分离株感染bgm和vero细胞。在指定的时间点收集上清液，用于定量测定。在这两种细胞中，病毒rna拷贝数在感染后72小时达到峰值(图3a)；病毒滴度的峰值出现在感染后48小时((图3b)，虽然此时只能观察到部分细胞变性。感染后48小时的病毒滴度高达107tcid
50
/ml，与sars-cov-2在这个时间点的滴度相当【6】。gx_p2v分离株在两种细胞中的生长曲线大致相似，但在感染后24小时和120小时滴度有显著差异(图3b)。感染后120小时vero细胞中检测到更高的病毒滴度(p《0.001)。同以上结果一致，与bgm细胞相比，vero细胞在感染后72小时有更多的细胞裂解，在感染后120小时产生了相对较大的病毒斑块(p《0.0001)(图2a和2d)。
72.实施例3.穿山甲冠状病毒gx_p2v分离株在叙利亚金黄仓鼠感染模型中毒力大幅减弱
73.材料和方法
74.1、gx_p2v分离株对仓鼠的致病性：在sars-cov-2发病机制的研究中发现，叙利亚金黄仓鼠模型对sars-cov-2高度易感【7、8】，sars-cov-2经鼻感染仓鼠后，sars-cov-2能在仓鼠肺组织中进行有效的复制，可造成肺部严重的病理性病变【9】，并且与人感染sars-cov-2后肺部的损伤特征相一致，包括严重的、双侧的、外周分布的、多小叶磨玻璃影和肺实变【8、9】。由于穿山甲冠状病毒gx_p2v的刺突蛋白与人类ace2的结合能力和sars-cov-2相当【3】，因此，本发明采用叙利亚金黄仓鼠作为gx_p2v分离株致病性研究的动物模型。spf级6周龄雄性叙利亚金黄仓鼠购于维通利华实验动物中心。分别将1.0
×
104tcid
50
和1.0
×
105tcid
50 gx_p2v分离株定容至50μl含2％胎牛血清的rpmi 1640培养基中，将仓鼠分3组，每组3只，含2％胎牛血清的rpmi 1640培养基为对照组。用戊巴比妥钠深度麻醉后，通过滴鼻方式感染gx_p2v分离株。在病毒感染后第2-14天，定期观察并记录仓鼠的体重变化和临床症状。左肺和气管的下半段置于4％多聚甲醛中室温保存，用于观察病理变化，其余组织直接于-40℃冷冻用于检测病毒滴度。
75.2、肺和气管中病毒rna拷贝数和病毒滴度的测定：先将对照组和gx_p2v分离株感染组的肺和气管组织称重，按每10mg组织加100μl pbs，之后用组织研磨仪(净信，上海)在60hz下匀浆4次。4℃ 5000
×
g离心5分钟后，用病毒dna/rna提取试剂盒从组织上清中提取总病毒rna用于qrt-pcr分析。采用tcid
50
法检测和计算组织上清中的病毒滴度，并以tcid
50
/ml表示。
76.3、肺和气管的组织病理学观察：在冷冻和固定前对肺和气管进行肉眼观察并拍照。左肺和气管的下半段用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作石蜡切片进行h&e染色。用显微镜观察肺和气管组织的病理变化。组织病理学结果由专业病理医师进行分析。
77.统计分析
78.采用graphpad prism 9.0版软件进行分析。两组间的差异采用双尾student t检验进行分析。p值小于0.05(p《0.05)认为有统计学意义。
79.实验结果
80.本发明研究了gx_p2v分离株在叙利亚金黄仓鼠中的复制能力和致病性。数据显
示，gx_p2v分离株感染的结果与sars-cov-2感染仓鼠的结果明显不同。与对照组相比，感染了1
×
105tcid
50 gx_p2v分离株的仓鼠体重持续增加，未见明显的临床症状(图4a)。与无临床表现相一致的是，在感染早期(感染后第2天和第5天)，感染组仓鼠肺表面仅出现轻微充血(图4b)。此外，所有感染组中仓鼠的气管均未发现支气管炎征象(图4b)。
81.为了阐明病毒的复制特点，在指定的时间点收集叙利亚金黄仓鼠的右肺和气管上半段(图5)。分别用qpcr和tcid
50
测量病毒rna拷贝数和病毒滴度。在肺和气管中，病毒rna拷贝数分别在感染后第2天和感染后第5天达到峰值，并在感染后14天内逐渐减少(图5a和b)。肺和气管中的病毒rna拷贝数都大于原始接种量，表明病毒在肺部和气管中都发生了有效的复制。然而，病毒滴度只能在感染早期检测到，肺组织中为感染后第2天和第5天，气管中为感染后第2天(图5c和5d)，这表明病毒在两个器官中复制的时间较短，而且气管支持病毒复制的能力可能较低。
82.苏木精和伊红染色法检测肺和气管的组织病理学变化。结果发现，1
×
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感染组仓鼠肺部与对照组相比未见明显异常变化(图6a)。1
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感染组中，仅在感染后第5天肺部伴有轻度炎症反应，而在其他检测时间点未见明显异常(图6b)。因此，在两个感染组中，gx_p2v分离株均未诱发严重的肺和气管损伤。叙利亚金黄仓鼠感染gx_p2v分离株后，肺部未发生严重的病理性损伤和gx_p2v分离株在体内短暂的复制结果表明，gx_p2v分离株在仓鼠模型中可能是减毒的。
83.仓鼠对sars-cov和sars-cov-2高度易感，但不同菌株和不同途径感染的结果各不相同【7、10、11】。sars-cov urbani毒株感染仓鼠后，在肺组织中检测到了高浓度的sars-cov rna，且呼吸道发生了显著的病理变化，但未见体重减轻或其他临床表现。一项研究报道了一种致命的sars-cov frk-1毒株，该毒株与urbani毒株的区别在于s2存在l1148f突变。仓鼠经肠道感染sars-cov-2后变现出与人类感染sars-cov-2后相似的临床症状【7、9、12】。总的来说，无论是sars-cov还是sars-cov-2经鼻感染的仓鼠，其肺部的病毒持续时间和显著病理变化都是一致的。gx_p2v分离株在叙利亚金黄仓鼠肺中的病毒载量和病毒滴度与这两种高致病性病毒相似，但没有引起严重的病理改变或发生疾病的迹象。
84.以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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