一株海洋沉积物芽孢杆菌及其降解赭曲霉毒素A的应用

一株海洋沉积物芽孢杆菌及其降解赭曲霉毒素a的应用
技术领域
1.本发明属于微生物学及生物降解技术领域，特别是涉及一株海洋沉积物芽孢杆菌及其降解赭曲霉毒素a（ochratoxin a，ota）的应用。


背景技术：

2.赭曲霉毒素 a（ota）化学名称为 7
‑
（l
‑
β
‑
苯基丙氨基
‑
羰基）
‑
羧基
‑5‑
氯代
‑8‑
羟基
‑
3，4
‑
二氢化
‑
3r
‑
甲基异氧杂奈邻酮，由异香豆素通过酰胺键与β
‑
苯丙氨酸相连形成，分子式为 c
20
h
18
clno6，摩尔分子量为 403.81 g/mol，熔点为 169 ℃。
3.ota是曲霉属和青霉属等产毒真菌产生的有毒次级代谢产物，1993 年国际癌症研究机构（the international agency for research on cancer, iarc）已将 ota 列为“2b”类致癌物。自然界中产生 ota 的真菌种类繁多，它们主要侵染粮谷物及各种农副产品，造成农作物原料及其加工产品中ota污染。这种污染可传递到土壤和水中，也可通过食物链传递给动物和人类，危害极大。ota 的主要靶器官为肝和肾，还能致畸、致突变、致癌和破坏免疫系统。
4.根据作用机理不同，可以将ota 的脱毒方法分为三种：物理方法，化学方法和生物方法，它们通过吸附、修饰或分解的方式来降低或消除 ota 的毒性，其中生物降解法作用条件温和，不会破坏产品品质，降解效率高，安全性好，因而受到广泛关注。ota 的生物降解通常是将 ota 水解为具有很低的毒性的赭曲霉毒素 α（ochratoxinα，otα）和β
‑
苯丙氨酸。ota的降解菌和降解酶的研究已取得一定的进展，目前报道的可以降解ota的细菌有鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、醋酸钙不动杆菌（acinetobacter calcoaceticus）、不动苯基杆菌(phenylobaterium immobile)、地衣芽胞杆菌 (bacillus licheniformis)等，真菌有解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica）、酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）、烟曲霉(aspergillus fumigatus) 和黑曲霉 (aspergillus niger)等。目前，未见关于海洋沉积物芽孢杆菌降解ota的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株可以降解赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)的海洋沉积物芽孢杆菌，利用该菌降解ota的方法安全简便、绿色无残留。
6.本发明的另一个目的是利用所述海洋沉积物芽孢杆菌制成各种降解ota的产品。
7.为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：本发明提供一株海洋沉积物芽孢杆菌，分类海洋沉积物芽孢杆菌(cytobacillus oceanisediminis)，菌名为co29，其分类命名为cytobacillus oceanisediminis，保藏编号为cgmcc no. 22874。已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc) (地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no. 22874。与其它生物的情况一样，具有降解ota的海洋沉积物芽孢杆菌(cytobacillus oceanisediminis)仍然易发生变异。因此，可以利用本领域
已知的物理和化学诱变方法得到该菌株的突变株。这些突变株，只要保留了ota降解能力这样一个特征，也属于本发明的一部分。
8.本发明进一步公开了含有海洋沉积物芽孢杆菌(cytobacillus oceanisediminis) co29或其细胞内溶物的生物脱毒剂，所述海洋沉积物芽孢杆菌(cytobacillus oceanisediminis) co29保藏编号为cgmcc no. 22874，所述生物脱毒剂为液体型或固体型。生物脱毒剂的制备方法，包括：将保藏编号为cgmcc no. 22874的海洋沉积物芽孢杆菌co29活化，多级扩培，当菌体处于稳定期时，收集发酵培养物，制得液体型生物脱毒剂；或将发酵培养物离心，收集菌体并破碎，获得细胞内溶物，制得液体型生物脱毒剂；或将发酵培养物离心，收集菌体并冻干或加入吸附剂制得固体型生物脱毒剂；或将发酵培养物离心，收集菌体并破碎，获得细胞内溶物，将该内容物冻干或吸附制得固体型生物脱毒剂。
9.本发明更进一步公开了海洋沉积物芽孢杆菌co29在制备降解赭曲霉毒素a制剂中的应用，以及所制得的生物脱毒剂在制备降解赭曲霉毒素a制剂中的应用。实验结果显示：本发明提供的海洋沉积物芽孢杆菌co29以及其细胞内溶物对ota的降解率均可达到100％，且降解反应为不可逆的生物降解。本发明提供的海洋沉积物芽孢杆菌co29对ota具有降解作用，降解产物为otα和和β
‑
苯丙氨酸，毒性降低至少1000倍，无免疫毒性。此外，本发明提供的海洋沉积物芽孢杆菌co29培养条件简单，生长快，降解ota效率高，可用于制备ota的生物脱毒剂，可大规模应用于ota污染物的脱毒处理。
10.本发明更加详细的描述如下：本发明进一步公开了一株海洋沉积物芽孢杆菌co29的培养方法，以及海洋沉积物芽孢杆菌降解ota产品的制备方法：步骤a，海洋沉积物芽孢杆菌co29用na培养基于37℃倒置培养；步骤b，液体培养时用nb培养基，摇床的转速为180 r/min。该菌在nb培养基预培养12h后，以1%的接种量接种于摇瓶发酵培养，即获得海洋沉积物芽孢杆菌co29的发酵培养物；步骤c，优选地，该发酵培养物经离心、过滤等不影响菌体活性的方法浓缩后得到浓度较高的菌悬液；更优选地，对发酵培养物进行离心分离处理，获得海洋沉积物芽孢杆菌co29湿菌体，海洋沉积物芽孢杆菌co29再经过重悬、细胞破碎处理和离心分离处理获得酶制剂；进一步地，也可以利用本领域现有方法制备将该液体型生物脱毒剂制成固体型生物脱毒剂，例如冻干或加入吸附剂等。
11.上述生物脱毒剂可采用本领域的常规包装技术包装，依据具体环境条件保存。
12.所述发酵培养基的配方：na培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，琼脂2％，加蒸馏水至1l，ph7.0
‑
7.2，121℃灭菌20min。
13.nb培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加蒸馏水至1l，ph7.0
‑
7.2，121℃灭菌20min。
14.海洋沉积物芽孢杆菌co29的形态学特征和生理生化特性。(表1)表1海洋沉积物芽孢杆菌co29的形态学特征和生理生化特性
附图说明
15.图1海洋沉积物芽孢杆菌co29 发酵时间与脱毒率的关系；图2灭活对海洋沉积物芽孢杆菌co29脱毒能力的影响；图3 破碎对海洋沉积物芽孢杆菌co29脱毒能力的影响；图4 海洋沉积物芽孢杆菌co29细胞內溶物降解ota的hplc
‑
fld图谱。注：a
‑ꢀ
pbs缓冲液；b
‑
ota标准品；c
‑
经细胞內溶物处理24h的ota样品；图5海洋沉积物芽孢杆菌co29细胞內溶物处理24h的ota样品的hplc
‑
ms/ms图谱。注：a
‑ꢀ
tic图；b
‑
otα的eic图；c
‑
otα的一级质谱图；d
‑
otα的二级质谱图；图6海洋沉积物芽孢杆菌co29在na培养基培养基上所观察形态照片；
图7海洋沉积物芽孢杆菌co29经革兰氏染色光学显微镜所观察形态照片。
具体实施方式
16.下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
17.实施例1海洋沉积物芽孢杆菌co29分离、纯化与鉴定1、富集菌株的采集、分离样品取自葡萄园土样。土样采集后进行除杂、磨碎，将5g样品在45mlnb培养基中制成悬液，37℃，180r/min富集24h后，取菌液使用生理盐水按照稀释涂布法以合适的稀释度涂布在na平板，37℃倒置培养24h后，挑取分离程度良好且菌落形态不同的单菌落，在na平板上进一步划线纯化，反复三次。
18.2、初筛由于ota标准品昂贵且毒性很大，故采用了价格低廉且毒性较小的ota结构类似物－香豆素替代ota作为初筛培养基中唯一碳源，因此，能在初筛培养基上生长的菌株具有降解ota的潜力。
19.将分离菌株接种于初筛固体培养基，37℃倒置培养48h。为保证菌株生长不受原培养基成分影响，保证香豆素为唯一碳源，将生长状态较好的菌株以相同方法接种于初筛固体培养基上，此步骤重复2次。对仍生长良好的菌株进行复筛。
20.初筛固体培养基：0.25gkh2po4，0.25gmgso4·
h2o，0.5gkno3，0.5g(nh4)2so4，0.005gcacl2，0.003gfecl3·
6h2o，加蒸馏水至1l，ph7.0
‑
7.2，121℃灭菌20min。加入过滤除菌后的香豆素溶液至1g/l。
21.3、ota纯品脱毒复筛初筛菌株接种于ota浓度为1μg/ml的ota
‑
nb培养基中进行脱毒试验，无菌发酵培养基作为空白对照，避光条件下，37℃，180r/min培养72h，检测ota的含量，经过反复的筛选最终获得一株能够降解ota的菌株，编号为co29。
22.采用形态学、生理生化和16srdna序列分析等分类法对降解菌株进行分类鉴定。
23.co29的形态学特征和生理生化特性见表1、图6、图7。
24.16srdna序列分析：利用引物27f(5
’‑
agagtttgatcmtggctcag
‑3’
)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)进行pcr扩增，长度为1409bp16srdna序列(16srdna如序列表2所示)与genbank数据库中已有序列进行blast比对，该序列与海洋沉积物芽孢杆菌16srdna同源性达100.00%；表2co29菌株的16srdna序列tggctccaatggttaccccaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaatggttttatgggattcgcttaacctcgcggtctcgcagccctttgtaccatccattg
tagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcatcctgtcccccgaaggggaacgccctatctctagggttgtcaggagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttgctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccaaagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactcttctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaaggaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccggcagttactccggtacttgttcttccctaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggcccatctgtaagtgatagccgaaaccatctttcagctttccctcatgtgagggaaagaattatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctgacttcagggagcaagctcccatctgtccgctcgactg实施例2ota和otα的检测方法hplc
‑
fld检测方法：具体如下：吸取200μl样品，于12000r/min下离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤，用hplc
‑
fld进行分析或将样品于4℃保存。hplc
‑
fld检测条件:采用kromstartm hplc反相c18柱（250
×
4.6 mm，5 μm）；激发波长：333 nm，发射波长：460 nm；流动相乙腈:水:醋酸=99:99:2（v/v/v）；流速：1.0 ml/min，进样量20 μl。
25.hplc
‑
ms/ms检测方法：水解产物均用孔径为0.22 μl滤器进行过滤处理，并用hplc
‑
ms/ms进行检测。
26.色谱条件：phenomenex gemini 3u c18 110a色谱柱(150 mm
×
2.00 mm，3μm)，流动相a为乙腈，b为含5mm乙酸铵的水溶液，洗脱梯度：0~5min，95% b；5~35min，线性减少到5% b；35~45min，5% b；45~50min，线性增加到95% b；50~60min，95% b；进样量：2μl；流速：0.3 ml/min；柱温：40℃。
27.质谱条件：大气压电喷雾离子源（api
‑
esi），负离子扫描模式；毛细管电压4 kv；干燥气体温度300℃，雾化器压力60 psi，干燥气体流速10 l/min。
28.降解率（脱毒率）=[（空白组上清ota含量
‑
对照组上清液ota含量）/空白组上清液ota含量]
×
100%实施例3海洋沉积物芽孢杆菌co29用于降解ota海洋沉积物芽孢杆菌co29培养：挑取海洋沉积物芽孢杆菌co29 (保藏号：cgmcc no. 22874)单菌落，接种于5ml nb培养基中，培养温度37℃，转速180 r/min，培养时间12h。发酵结束后，将发酵培养物留存备用。
[0029]
取制备的海洋沉积物芽孢杆菌co29发酵培养物500μl，接种于50ml ota
‑
nb培养基
中，培养温度为37℃，分别在培养24h、36h、48h、72h取样，以不接菌的ota
‑
nb培养基为空白对照组，测定ota含量，并计算脱毒率。试验重复至少3次。
[0030]
nb培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加蒸馏水至1l，ph7.0
‑
7.2，121℃灭菌20min。
[0031]
其中ota
‑
nb培养基制备方法：将一定体积的ota母液(1mg/ml)转移至无菌三角瓶中，加入一定体积的nb培养基充分溶解，配成ota终浓度为1 μg/ml的ota
‑
nb培养基后按需分装。
[0032]
其中ota的hplc
‑
fld检测方法参见实施例2。
[0033]
检测结果：37℃下培养时，海洋沉积物芽孢杆菌co29皮特不动杆菌ap19反应48h，降解率超过90％；反应72h，降解率为100％。(图1)。
[0034]
实施例4海洋沉积物芽孢杆菌co29降解机理的初步研究海洋沉积物芽孢杆菌co29培养：取实施例3中的制备的海洋沉积物芽孢杆菌co29发酵液500μl，接种于50mlnb液体培养基中，培养温度37℃，转速180 r/min，培养时间48h。发酵结束后，发酵培养物留存备用。
[0035]
1、菌体降解ota：取10ml发酵液，离心去除上清液，菌体使用冰浴后的pbs缓冲溶液重悬，洗涤菌体2次。最后，加入1mlota终浓度为1μg/ml的 ota
‑
pbs重悬菌体。在第4h和24h测定ota的含量，并计算脱毒率。
[0036]
2、灭活菌体降解ota：取10ml发酵液，离心去除上清液，菌体使用冰浴后的pbs缓冲溶液重悬，洗涤菌体2次，灭活菌体。最后，加入1mlota终浓度为1μg/ml的 ota
‑
pbs重悬菌体。在第4h和24h测定ota的含量，并计算脱毒率。
[0037]
3、发酵上清液降解ota：取1ml的发酵上清液，加入一定体积的ota母液(1mg/ml)，与发酵上清液充分混合(ota终浓度为1μg/ml) 在第12h和24h测定ota的含量，并计算脱毒率。
[0038]
4、细胞內溶物降解ota：取10ml发酵液，离心去除上清液，菌体使用冰浴后的pbs缓冲溶液重悬，超声破碎。取1ml的细胞內溶物，加入一定体积的ota母液(1mg/ml)，与细胞內溶物充分混合(ota终浓度为1μg/ml) 在第12h和24h测定ota的含量，并计算脱毒率。
[0039]
pbs磷酸缓冲盐溶液（ph 7.4）：nacl 8.5 g，na2hpo4·
12h2o 2.9 g，kh2po
4 0.24 g，ph7.2
‑
7.4，蒸馏水定容到1 l。
[0040]
nb培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加蒸馏水至1l，ph7.0
‑
7.2，121℃灭菌20min。
[0041]
其中hplc
‑
fld的检测方法参见实施例2。
[0042]
检测结果：灭活菌体处理24h ota的减少率为47.62％；未经处理的菌体处理24h的降解率为100％，这说明菌体处理ota有吸附作用但主要是降解作用。(图2)。
[0043]
发酵上清液处理24h ota的减少率为10.27％；细胞內溶物处理24h的降解率为100％，这说明海洋沉积物芽孢杆菌co29处理ota主要是降解作用，且活性物质主要存在于
菌体内。(图3)。
[0044]
实施例5ota降解产物分析以实施例3所述制备降解产物和空白对照，反应24h后用hplc
‑
fld和hplc
‑
ms/ms检测分析。
[0045]
检测结果：经hplc
‑
fld检测ota的保留时间为10.567min，反应24h，ota降解率为100％；在3.952 min 出现一新峰，可能为ota的降解产物(图4)，经hplc
‑
ms/ms分析，255.2465为otα减氢离子。可以确定此为otα的离子峰。因此，海洋沉积物芽孢杆菌co29的降解产物中确含otα (图5)。
[0046]
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。