长链非编码RNALINC01565在急性髓系白血病预后中的应用的制作方法

长链非编码rna linc01565在急性髓系白血病预后中的应用
技术领域
1.本发明涉及白血病预后评估技术领域，具体涉及长链非编码rna linc01565在急性髓系白血病预后中的应用。


背景技术：

2.急性髓系白血病(aml)是一种遗传多样性的造血系统恶性肿瘤，其髓系分化和成熟受到干扰。先进的治疗方法发展迅速，但许多急性髓系白血病患者仍经历不良结局。传统上，化疗和异基因造血干细胞移植是急性髓系白血病患者的两种主要治疗方法。目前已发现许多基因突变，如npm1、flt3
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itd和dnmt3a可作为aml的预后因素，但这些突变的预后影响仍不理想。因此，在急性髓系白血病中识别具有更好预后表现的预后因素非常重要。
3.长非编码核糖核酸是长度超过200纳米的非编码核糖核酸家族的成员。尽管lncrnas的蛋白质编码能力有限，甚至没有该能力，但它们参与了许多重要的生物学过程，包括剪接、转录、表观遗传基因表达和染色质修饰。竞争性内源性核糖核酸假说(cerna)假设lncrnas可以通过海绵化微小核糖核酸来调节mrnas的表达。在肿瘤细胞中，lncrnas也在增殖、迁移、侵袭和抵抗中发挥重要作用。许多研究发现，在急性髓系白血病中lncrnas调节失调。例如，过度激活lncrna sox61导致aml细胞系中细胞增殖增加并抑制细胞凋亡。lncrna sbf2
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as1通过海绵抑制肿瘤抑制因子mir
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188
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5p抑制白血病细胞凋亡和细胞周期停滞。lncrna h22854表达的降低与复发的高风险相关。linc01565，又名gr6和c3orf27，是一种长基因间非蛋白编码rna。据报道，gr6在uscd
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aml1细胞系和伴有3q21q26综合征的aml患者中被激活。然而，linc01565在急性髓系白血病中的作用以及linc01565与急性髓系白血病预后的关系仍有待阐明。


技术实现要素：

4.本发明通过从tcga数据库、target数据库和gtex数据库分别下载两个aml队列和一个正常骨髓样本队列的转录组谱，用deseq2在tcga
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aml队列和gtex队列之间进行lncrnas的差异表达分析。kaplan
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meier生存分析和对数秩检验用于评估linc01565在tcga
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aml队列和target
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aml队列中的预后价值。差异表达基因的功能富集和cerna网络用于研究linc01565在急性髓系白血病中的潜在机制。
5.在gepia数据库的33种肿瘤中，linc01565在aml中的表达最高，在tcga
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aml队列中linc01565的表达与正常组织相比显著上调。此外，linc01565的高表达与tcga成人急性髓系白血病队列和target儿童急性髓系白血病队列的不良预后相关。此外，linc01565的高表达也表明仅接受化疗的患者预后不良，而在tcga
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急性髓系白血病队列中接受同种hsct治疗的患者中未发现显著差异。多变量分析表明linc01565是急性髓系白血病的独立预后因素。差异基因和功能富集分析显示，linc01565可能通过参与或影响ecm受体互作通路和一些与免疫相关的信号通路如细胞因子
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细胞因子受体相互作用信号通路和中性粒细胞胞外陷阱形成信号通路对aml进行调控。
6.基于linc01565相关的cerna网络建立了一个预后模型，cerna网络分析显示，linc01565与microrna mir
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210和mir
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152以及13个蛋白质编码基因共同组成调控aml疾病的网络，该网络可能通过影响过渡金属离子转运通路对aml进行调控。
7.进一步地发现linc01565在急性髓系白血病中上调，是急性髓系白血病稳定的不良预后因素，但其预后影响可被allo
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hsct超越。这一发现初步揭示了linc01565在急性髓系白血病中的作用，为急性髓系白血病的诊断和治疗提供了新的视角。
附图说明
8.图1为linc01565的基因表达分析中，利用pegia数据库研究linc01565在泛癌组织中的表达结果。
9.图2为linc01565的基因表达分析中，linc01565在tcga
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aml队列和tcga
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aml队列两种不同样本类型中的表达情况。
10.图3为linc01565的基因表达分析中，linc01565在eln分层系统分层的不同aml患者中的表达情况。
11.图4为linc01565的基因表达分析中，linc01565在按细胞遗传学分层的八个亚组急性髓系白血病患者中的表达情况。
12.图5为tcga
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aml队列和target
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aml队列中linc01565不同表达的总生存率(os)和无事件生存期(efs)的卡普兰
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迈耶曲线。a)tcga
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aml队列中linc01565高表达组和低表达组的os卡普兰
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迈耶曲线。b)tcga
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aml队列中linc01565高表达组和低表达组的efs卡普兰
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迈耶曲线。c)target
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aml队列中linc01565高表达组和低表达组的os卡普兰
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迈耶曲线。d)tcga
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aml队列中linc01565高表达组和低表达组的efs卡普兰
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迈耶曲线。
13.图6为不同linc01565表达组的临床特征，x轴是linc01565高表达组的频率，y轴是linc01565低表达组的频率。
14.图7为tcga
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aml队列中接受不同治疗的患者总生存期(os)和无事件生存期(efs)的卡普兰
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迈耶曲线。a)linc01565高表达组和低表达组接受化疗的os的卡普兰
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迈耶曲线。b)linc01565高表达组和低表达组接受化疗的efs卡普兰
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迈耶曲线。c)linc01565高表达组和低表达组接受骨髓移植的os的卡普兰
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迈耶曲线。d)linc01565高表达组和低表达组的接受骨髓移植的efs的卡普兰
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迈耶曲线。
15.图8为linc01565 cerna网络。
具体实施方式
16.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
17.1、材料和方法
18.gepia分析
19.gepia数据库(http://gepia.cancer
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pku.cn)是一个基于网络的工具，基于癌症基因组图谱(tcga)和基因型组织表达项目(gtex)数据提供快速和可定制的功能。在功能模块，我们使用linc01565的ensembl gene id：ensg00000198685进行单基因分析，选择默认值作为阈值。
20.数据收集
21.从tcga(https://www.cancer.gov/)数据库下载了151例急性髓系白血病患者的完整的转录组谱、microrna表达谱和临床数据。作为验证，本研究还纳入了来自target数据库的187名儿童白血病患者，转录组概况和临床数据可在target网站(https://ocg.cancer.gov/programs/target)上查阅。而且还从gtex数据库(https://gtexportal.org/)下载了70个正常骨髓样本的转录组图谱。
22.基因表达分析
23.通过r voom包从原始计数转换而来对数cpm值用于测量基因的表达。tcga
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aml队列和gtex队列linc01565表达的比较用deseq2分析(|fc|≥1.5，p≤0.01)。通过方差分析(anova)方法检测linc01565在欧洲白血病网(eln)分层组或细胞遗传学亚型中的差异表达。所有统计分析均使用4.0版进行。
24.预测分析
25.剔除了15名m3型患者后，根据linc01565的表达中位数将总共136名患者分为两组：linc01565高表达和linc01565低表达，所述患者是aml的独特亚型，具有独特的临床特征和治疗策略，且预后良好。进行卡普兰
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迈耶分析和对数秩检验，比较两组的总生存率和无事件生存率。进行多变量分析以证明linc01565表达作为急性髓系白血病预后因素的独立性。显著性阈值为p值<0.05。
26.差异基因和功能富集分析
27.本研究差异基因分析采用deseq2进行，差异基因分析阈值为fdr<0.01，|logfc|>1。kegg分析和gsea分析使用r包“clusterprofiler”中的gsekegg和gsepathway函数进行，gsea分析的参数为nperm＝1000,mingssize＝10,maxgssize＝1000,pvalue
‑
cutoff＝0.05。
28.cerna网络构建及分析
29.用差异表达的micrornas和从差异表达基因中选择的mrnas构建了linc01565cerna网络，cerna网络采用gdcrnatools工具来构建并使用r包“igraph”进行可视化。gdcrnatools工具使用三个标准来确定lncrna mrna对之间的竞争性内源性相互作用：lncrna和mrna必须共享大量mirna；lncrna和mrna的表达必须呈正相关；mirna在调控lncrna和mrna的表达中应起相似的作用。因此，cerna网络的构建满足以下要求:hyperpvalue>0.01，corpvalue>0.01，regsim＝0。mircode用于收集预测的和实验验证的lncrna靶标。starbase v2.0用于预测mirna
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mrna相互作用。cerna网络的功能性分析使用在线工具metascape(http://metascape.org/)进行。然后我们使用lasso回归分析构建了基于cerna网络的预后模型。tcga
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aml队列根据危险评分的中间值分为高风险组和低风险组，kaplan
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meier分析用于分析两组总生存期的差异，roc曲线用于进一步确定该预后模型的可靠性。
30.结果
31.1.linc01565在急性髓系白血病中的高表达
32.在gepia数据库中，发现linc01565在急性髓细胞样白血病、肝细胞癌(lihc)和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pcpg)中高表达。值得注意的是，linc01565在急性髓系白血病中的表达最高(图1)。接下来，tcga
‑
aml队列和gtex的正常骨髓样本中linc01565表达的比较显
示，aml患者的linc01565表达明显高于正常骨髓样本(图2，log2(fc)＝6.313，fdr＝3.09e
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70，p<0.0001)。然后，tcga
‑
aml队列中的患者被eln分层系统分为三个亚组：有利、中等和不利。结果显示三组之间存在微弱的显著差异(图3，p＝0.03)。随后，根据细胞遗传学将急性髓系白血病患者分为8个亚组：runx1
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runx1t1、cbfb
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myh11、mll、pml
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rara、bcr
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abl1、正常、复杂和其他。cbfb
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myh11患者和pml
‑
rara患者的linc01565表达均低于其他细胞遗传学患者，但在八个亚组中未发现显著差异(图4，p＝0.11)。
33.2、linc01565的高表达与急性髓系白血病的不良预后相关
34.根据linc01565的中位表达，将急性髓系白血病患者分为linc01565高表达组和linc01565低表达组。在tcga
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aml队列中，linc01565高表达患者的总生存期(os)(图5中a，p＝0.00764)和无事件生存期(efs)(图5中b，p＝0.0174)明显短于linc01565低表达患者。在target
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aml队列中linc01565高表达患者的总生存期(os)(图5中c，p＝0.00169)和无事件生存期(efs)s(图5中d，p＝0.00723)也较低。
35.3、不同linc01565表达的临床和分子特征比较
36.如图6所示，在linc01565高表达组中发现了更多npm1突变的aml患者(p＝0.013)。而linc01565低表达组比linc01565高表达组有更多idh2突变(p＝0.038)或kras突变(p＝0.006)的aml患者。此外，大多数患有cbfb
‑
myh11的急性髓系白血病患者出现在linc01565低表达组(p＝0.021)。其他特征在两组间无统计学意义，包括治疗(化疗与造血干细胞移植)、年龄(<60岁与≥60岁)、性别(男性与女性)、白细胞计数(<15
×
109/l和≥15
×
109/l)、骨髓细胞计数(<20％和≥20％)、外周血细胞计数(<70％与≥70％)以及其他复发性基因突变的频率(flt3
‑
itd、idh1/2等，野生型对突变)。详情见表1。
37.表1 linc01565高表达和低表达的临床和分子特征
38.39.[0040][0041]
4、不同治疗方法对急性髓系白血病患者linc01565表达的影响
[0042]
tcga
‑
aml队列中的患者被分为仅接受化疗的70名患者和接受同种异基因造血干细胞移植(allo
‑
hsct)的66名患者。在仅化疗组，linc01565高表达的患者与较短的总体生存率(os)(图7中a，p＝0.00834)和无事件生存(efs)(图7中b，p＝0.0203)相关。尽管如此，在allo
‑
hsct组中，在os(图7中c，p＝0.112)和efs(图7中d，p＝0.38)中linc01565的高表达和低表达之间没有发现显著差异。
[0043]
5、linc01565相关生物途径的探索
[0044]
选择216个下调基因和329个上调基因作为差异表达基因。kegg通路分析和gsea分析表明，degs主要富集于细胞外基质
‑
受体相互作用、轴突导向和一些免疫相关通路，如细胞因子
‑
细胞因子受体相互作用和中性粒细胞细胞外陷阱形成。
[0045]
6、cerna网络建设与分析
[0046]
选择差异表达的microrna和mrna构建与linc01565相关的cerna网络。linc01565与两个microrna相关：mir
‑
210和mir
‑
152，以及十三个mrnas，包括zfpm1、rgs3、slc39a3、ppm1h、tfr2、bspry、atp7b、wdr35、nat6、spaca9、ctsw、amn和hbd(图8)。对这些linc01565相关microrna和mrnas的功能富集分析表明，cerna网络可能通过过渡金属离子转运信号通路在aml中发挥作用。
[0047]
构建的以linc01565为中心的参与过渡金属离子转运信号通路的cerna网络发现，过渡金属如铜和铁在许多生命过程中起着关键作用。一种有希望的新方法包括施用过渡金属螯合剂和离子载体，以改变肿瘤微环境中必需过渡金属，例如铁(铁)、铜(铜)和锌(锌)的浓度、分布和氧化还原行为，这表明过渡金属离子转运信号通路是参与癌症发展的重要信号通路。因此，这一发现意味着以linc01565为中心的cerna网络在急性髓系白血病中也发挥了至关重要的作用，并为急性髓系白血病的诊断生物标志物搜索提供了新的思路。
[0048]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。