一株谷氨酸棒杆菌株及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株谷氨酸棒杆菌株及其应用。


背景技术：

2.谷氨酸棒杆菌是一种兼性厌氧、生长快速的革兰氏阳性菌，1957年，这种微生物首次从自然界中分离得到。由于其过量合成谷氨酸的能力被命名为谷氨酸棒杆菌。目前谷氨酸棒杆菌已被认为gras安全菌株，而且该菌株生理特性研究较为清晰，遗传操作和外源基因表达体系已建立，经过代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌重组菌株已经广泛应用于氨基酸、核苷酸、生物塑料以及其它精细化学品的工业化生产，目前氨基酸产能，约2/3是以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞进行发酵生产获取的，在生物制造产业中扮演重要角色。
3.d
‑
甘露糖是一种己醛醣，唯一用于在临床上的糖质营养素，具有多种生理功能，促进胰岛素分泌，诱导抗炎细胞因子表达，预防尿路感染，促进肠道益生菌生长。甘露糖广泛存在于魔芋、酵母细胞壁等多种生物质资源中，同时也是半纤维素中一种主要的六碳糖单元，含量仅次于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。截至目前，研究人员已开发高效利用木糖和阿拉伯糖的工业菌株，但是针对甘露糖代谢利用报道较少，因此，甘露糖高效代谢，促进半纤维素转化利用，将对提升半纤维素甚至天然木质纤维素的附加值具有重要意义。
4.甘露糖可被酵母菌株代谢利用，但是可发酵利用甘露糖的细菌报道较少，有研究通过提高细胞内甘露糖6
‑
磷酸异构酶活性，有助于提升谷氨酸棒杆菌代谢甘露糖能力，然而该菌株代谢利用甘露糖依然需要较高的菌体浓度，且甘露糖代谢速率较低。gdp
‑
甘露糖和gdp
‑
岩藻糖是生物体内合成甘露基聚糖和岩藻基聚糖的关键前体，其高效制备对于制备甘露寡糖和岩藻糖基乳糖的合成至关重要。甘露糖代谢非常有助于提升胞内gdp
‑
甘露糖和gdp
‑
岩藻糖的含量，因此迫切开发可高效代谢利用甘露糖的细菌菌株，合成更多种类的化学品。


技术实现要素：

5.本发明人通过筛选到可利用甘露糖的菌株且表现出比较优异的菌体生物量的谷氨酸棒杆菌株进而完成本发明。
6.本发明目的一是提供一株谷氨酸棒杆菌株，命名为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cgl
‑
m19 cgmcc no.22679菌株已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no.22679。
7.本发明目的二是谷氨酸棒杆菌株cgl
‑
m19在甘露糖代谢方面应用。其特征表现为，谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19可在富含甘露糖的培养基中进行生长代谢。
8.所述培养基不仅仅包括丰富培养基如lb培养基，脑心浸粉，玉米浆，玉米粉等，还包括基本盐培养基如m9基本盐培养基，cgxii基本盐培养基等。
9.所述富含甘露糖的培养基，不仅仅包含添加甘露糖的培养基，还应包括甘露聚糖
水解后获得甘露糖的培养基。
10.所述培养基中甘露糖浓度为0.1 g/l
‑
200 g/l，培养温度为25
‑
35℃。
11.本发明目的三是提供一株谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gm，其特征表现为，以谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19为出发菌株，通过引入甘露糖6
‑
磷酸变位酶基因（manb）和甘露糖1
‑
磷酸糖基转移酶基因（manc），获得谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gm。具体构建方法为：（1）构建重组载体pec
‑
manb
‑
manc根据谷氨酸棒杆菌来源的甘露糖6
‑
磷酸变位酶（manb）(seq id no.1)和甘露糖1
‑
磷酸糖基转移酶（manc）的核苷酸序列（seq id no.2）设计引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，pcr扩增获得manb和manc基因，通过限制性酶切连接方法，连接至重组表达载体pec
‑
xk99e中，得到重组质粒pec
‑
manb
‑
manc。
12.（2）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
m19中导入重组载体pec
‑
manb
‑
manc，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株cgl
‑
gm。
13.本发明目的四是提供谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gm在gdp
‑
甘露糖合成中的应用，其特征表现为，谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gm可发酵葡萄糖、甘露糖获得gdp
‑
甘露糖，其中谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gm发酵甘露糖时gdp
‑
甘露糖含量高于葡萄糖。
14.所述发酵条件为，甘露糖或葡萄糖浓度为5
‑
50 g/l, 所述培养温度为25
‑
35℃。
15.本发明目的五是提供一株谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf，其特征表现为，以谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19为出发菌株，通过引入甘露糖6
‑
磷酸变位酶基因（manb）和甘露糖1
‑
磷酸糖基转移酶基因（manc），gdp
‑
甘露糖4,6
‑
脱水酶基因（gmd）和gdp
‑
岩藻糖合成酶基因（wcag）,获得谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf。具体构建方法为：（1）构建重组载体pec
‑
manb
‑
manc根据谷氨酸棒杆菌来源的甘露糖6
‑
磷酸变位酶（manb）和甘露糖1
‑
磷酸糖基转移酶（manc）的核苷酸序列设计引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，pcr扩增获得manb和manc基因，通过限制性酶切连接方法，连接至重组表达载体pec
‑
xk99e中，得到重组质粒pec
‑
manb
‑
manc。
16.（2）构建重组载体pxmj19
‑
gmd
‑
wcag根据大肠杆菌来源的gdp
‑
甘露糖4,6
‑
脱水酶（gmd）（seq id no.3）和gdp
‑
岩藻糖合成酶（wcag）（seq id no.4）的核苷酸序列设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，pcr扩增获得gmd和wcag基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pxmj19中，得到重组质粒pxmj19
‑
gmd
‑
wcag。
17.（3）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
m19中导入重组载体pec
‑
manb
‑
manc和pxmj19
‑
gmd
‑
wcag，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株cgl
‑
gf。
18.本发明目的六是提供谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf在gdp
‑
岩藻糖合成中的应用，其特征表现为，谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf可发酵葡萄糖、甘露糖获得gdp
‑
岩藻糖，其中谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf发酵甘露糖时gdp
‑
岩藻糖含量高于葡萄糖。
19.所述发酵条件为，甘露糖或葡萄糖浓度为5
‑
50 g/l，培养温度为25
‑
35℃。
20.本发明筛选到可利用甘露糖的菌株且表现出比较优异的菌体生物量的谷氨酸棒杆菌株。进一步，本发明提供该菌株在生产甘露糖代谢方面的应用。其通过基因改造后能够高效生产gdp
‑
甘露糖、gdp
‑
岩藻糖合成。本发明经过实验验证了上述效果，因而具有较大的
应用价值。
附图说明
21.图1 谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19发酵代谢甘露糖绘制生长曲线和甘露糖消耗曲线。
具体实施方式
22.以下结合实施例进一步详述本发明。
23.本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(w/v，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(v/v，单位ml/100ml)百分比浓度。
24.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecular cloning: a laboratory manual》（sambrook，j.，russell， david w.，molecular cloning: a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor）。
25.各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
26.本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。
27.实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
28.实施案例1：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19的筛选和鉴定筛选样品取自天津汉沽根际土壤样品。
29.分离过程：称取2 g土壤样品，放入盛有30 ml无菌水的三角瓶中，于30℃，180rmp震荡30min, 取1ml土壤悬液进行梯度稀释10
‑1‑
10
‑7，然后取10
‑5，10
‑6，10
‑7三个稀释度涂布至含有甘露糖的富集培养基m中（甘露糖：5g/l; 琼脂：15g/l; (nh4)2so4(5g/l),尿素 (5g/l), kh2po
4 (1g/l), k2hpo
4 (1g/l), mgso4∙
7h2o (0.25g/l), cacl
2 (10mg/l), feso4∙
7h2o (10mg/l), mnso4∙
h2o (0.1mg/l), znso4∙
7h2o (1mg/l), cuso4∙
5h2o (0.2mg/l), nicl2∙
6h2o (20μg/l), 生物素 (0.4mg/l), mops (42g/l) ,ph调至7.4），于28℃倒置培养1
‑
3天。
30.纯化过程：将在富集培养基m平板上生长起来的菌落，在另一含有甘露糖的富集培养基中进行划线培养。连续富集5次后，进行涂板画线。
31.菌株比较：经过连续富集获得了12株可利用甘露糖的菌株，将这12株菌株接种至以甘露糖为唯一碳源的基本盐培养基（甘露糖：10g/l; (nh4)2so4(5g/l),尿素 (5g/l), kh2po
4 (1g/l), k2hpo
4 (1g/l), mgso4∙
7h2o (0.25g/l), cacl
2 (10mg/l), feso4∙
7h2o (10mg/l), mnso4∙
h2o (0.1mg/l), znso4∙
7h2o (1mg/l), cuso4∙
5h2o (0.2mg/l), nicl2∙
6h2o (20μg/l), 生物素 (0.4mg/l), mops (42g/l) ,ph调至7.4）中，发酵48h，比较不同菌株最终生物量。
32.最终，筛选获得了菌株m19，该菌株表现出比较优异的菌体生物量，对该菌株进行16s rdna测序，依据基因序列分析，将该菌株鉴定为谷氨酸棒状杆菌属（corynebacterium glutamicum），并将其命名为谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19。
33.谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19菌株已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no. 22679。
34.实施案例2：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
m19发酵代谢甘露糖（1）cgl
‑
m19活化将保藏于甘油管中的菌株cgl
‑
m19在自制固体培养基平板上划线，培养48h进行活化。自制固体培养基按如下组成配制：cgxii培养基，甘露糖10g/l，琼脂15 g/l，ph=7.0，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。
35.（2）cgl
‑
m19种子液获得挑取自制固体培养基上的cgl
‑
m19单菌落，接种于装有10
‑
30 ml 发酵培养基的100 ml三角瓶中，培养温度为30℃，置于转速为150
‑
230 rpm的摇床上培养12
‑
16 h至对数期后期即可（图1）。发酵培养基按如下组成配制：cgxii培养基，甘露糖10g/l，ph=7.0，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。
36.（3）cgl
‑
m19发酵代谢甘露糖在装有50
‑
100 ml发酵培养基m的250 ml三角瓶中接入0.5%
‑
3%种子液，培养温度为30℃，置于摇床转速为150
‑
230 rpm的摇床上培养24
‑
48 h，发酵过程中取不同时间样品，测定其菌体密度od
600
，并绘制生长曲线和甘露糖消耗曲线。
37.结果发现，cgl
‑
m19发酵甘露糖具有较高的利用效率。
38.实施案例3：构建谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gm具体包括以下步骤：（1）构建重组载体pec
‑
manb
‑
manc
根据谷氨酸棒杆菌来源的甘露糖6
‑
磷酸变位酶（manb）和甘露糖1
‑
磷酸糖基转移酶（manc）的核苷酸序列设计引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，pcr扩增获得manb和manc基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pec
‑
xk99e中，得到重组质粒pec
‑
manb
‑
manc。
39.（2）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
m19中导入重组载体pec
‑
manb
‑
manc，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株cgl
‑
gm。
40.实施案例4：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
gm发酵甘露糖合成gdp
‑
甘露糖选用培养基（cgxii），培养基中添加20g/l甘露糖，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
20进行培养，发酵24h后，对样品进行收集，检测gdp
‑
甘露糖含量。
41.hplc检测方法：采用色谱柱inertsil ods
‑
sp和紫外检测器，流动相为a: (20 mm 三乙胺乙酸，ph 6.0)；b：乙腈；采用梯度洗脱方式：首先，采用100%的流动相a，10min；其次，流动相b采用线性梯度0
‑
4%，10min；再次，流动相b线性梯度4%
‑
0%；最后，100%流动相a，25min；流动相流速为0.6 毫升/分钟；紫外检测波长为254 nm。
42.经hplc检测，gdp
‑
甘露糖含量最高达到10.4
±
1.9毫克每克细胞干重。
43.实施案例5：构建谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf具体包括以下步骤：（1）构建重组载体pxmj19
‑
gmd
‑
wcag根据大肠杆菌来源的gdp
‑
甘露糖4,6
‑
脱水酶（gmd）和gdp
‑
岩藻糖合成酶（wcag）的核苷酸序列设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，pcr扩增获得gmd和wcag基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pxmj19中，得到重组质粒pxmj19
‑
gmd
‑
wcag。
44.（2）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
m19中导入重组载体pec
‑
manb
‑
manc和pxmj19
‑
gmd
‑
wcag，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株cgl
‑
gf。
45.实施案例6：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
gf发酵甘露糖合成gdp
‑
岩藻糖选用培养基（cgxii），培养基中添加20g/l甘露糖，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株cgl
‑
gf进行培养，发酵24h后，对样品进行收集，检测gdp
‑
岩藻糖含量。
46.hplc检测方法：采用色谱柱inertsil ods
‑
sp和紫外检测器，流动相为a: (20 mm 三乙胺乙酸，ph 6.0)；b：乙腈；采用梯度洗脱方式：首先，采用100%的流动相a，10min；其次，流动相b采用线性梯度0
‑
4%，10min；再次，流动相b线性梯度4%
‑
0%；最后，100%流动相a，25min；流动相流速为0.6 毫升/分钟；紫外检测波长为254 nm。
47.经hplc检测，gdp
‑
岩藻糖含量达到6.3
±
1.2 毫克每克细胞干重。