一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法与流程

一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，尤其涉及一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。


背景技术：

2.鲈弹状病毒是危害大口黑鲈、鳜鱼等名优鱼类养殖产业的重大病原之一，它是一种在自然界广泛分布的有囊膜的、单股负链单链rna病毒，感染宿主广、种类多，能引起多种淡水和海水鱼类出现严重的出血性败血症。通过比对发现，鲈弹状病毒与从乌鳢、鳜鱼、笋壳鱼上分离到的弹状病毒都属于弹状病毒科(rhabdovirus)，鲈弹状病毒属(perhabdovirus)。鲈弹状病毒有很高的传染性和致病性，可以通过亲本垂直传播和通过水源、鱼饵、带毒鱼、鱼卵、寄生虫进行水平传播。我们通过流行病学调查发现，鲈弹状病毒主要感染苗种，死亡率可达100％。为了尽早的发现鲈弹状病毒，及时切断病毒的传播，急需建立一种高灵敏度的检测方法。
3.聚合酶链反应(pcr)、间接酶联免疫吸附实验(间接elisa)和环介导等温扩增(lamp)等检测方法灵敏度高、操作简便，但是不能对结果进行定量分析，荧光定量pcr(qpcr)可以做定量分析，但是需要额外的标准品和标准曲线，且对低浓度病毒的定量结果较不稳定，无法在病毒低含量样品实现精准检测。微滴式数字pcr(ddpcr)是20世纪末，vogelstein等提出的一项核酸定量检测新技术。该方法是对各个反应单元的荧光信号进行判读，根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。与传统的定量pcr相比，ddpcr可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析，精确度和灵敏度更佳。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。本发明采用设计的特异性引物和探针与数字pcr结合的方式来检测鲈弹状病毒，将ddpcr技术用于鲈弹状病毒的检测，可以实现快速、准确的对鲈弹状病毒核酸进行绝对定量。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如seq id no：3所示。
6.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒包括无rna酶的蒸馏水、一步法ddpcr探针法预混液、探针法ddpcr微滴发生油、质控液、阴性对照和阳性对照。
7.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一步法ddpcr探针法预混液包括：dna聚合酶预混液、上游引物、下游引物、特异性探针和无rna酶蒸馏水。
8.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一步法ddpcr探针法预混液的总体积为950μl时具体包括：500μl dna聚合酶预混液、50μl上游引物、50μl下游引物、50μl特异
性探针和300μl的无rna酶蒸馏水。
9.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒；所述阴性对照为无rna酶蒸馏水。
10.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述引物和特异性探针的浓度均为10μm。
11.本发明同时提供一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的方法，所述方法为利用所述的试剂盒通过数字pcr技术进行检测。
12.作为本发明所述方法的优选实施方式，所述检测鲈弹状病毒的方法具体包括以下步骤：
13.(1)提取待测样品的总rna，反转录成cdna，作为pcr反应模板；
14.(2)配制ddpcr反应液，体积20μl，其配方为：一步法ddpcr探针法预混液18μl，待测样品cdna模板为2μl；
15.(3)制备微滴，按照液滴发生板上标记位置，分别在样品孔和油位孔加入ddpcr反应液20μl和微滴发生油70μl，然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴；将液滴生成孔中生成的微滴以一一对应的方式全部转入96孔板，用热封仪进行封膜；
16.(4)将封好膜的96孔板转入pcr仪中进行扩增；
17.(5)将完成pcr扩增的pcr板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中鲈弹状病毒检测结果。
18.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(4)中所述扩增的程序为：95℃预变性10min；94℃变性30秒，53
‑
65℃退火60秒，共40个循环；98℃10min，4℃恒温，结束反应，每步都设置2.5℃/秒的降温速度。
19.作为本发明所述方法的优选实施方式，所述退火的温度为59℃。
20.本发明的有益效果：
21.本发明采用微滴数字pcr技术检测鲈弹状病毒病毒，检测的灵敏度高，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接判读样品中鲈弹状病毒的核酸拷贝数，极大的简化了操作步骤。
附图说明
22.图1为本发明实施例3验证本发明引物和探针的特异性实验结果示意图；其中，b10表示：神经坏死病毒(nervous necrosis virus，nnv)；c10表示：大口黑鲈双rna病毒(largemouth bass birnavirus，lbbv)；d10表示：鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，svcv)；e10表示：草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，gcrv)；f10表示：传染性脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，isknv)；g10表示：大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass virus，lmbv)；f09表示：阴性对照组(无rna酶蒸馏水)；a09表示：鲈弹状病毒阳性质粒。
23.图2为本发明实施例4对检测鲈弹状病毒的数字pcr检测方法的退火温度优化结果示意图；其中，a05表示：65℃；b05表示：64.3℃；c05表示：63℃；d05表示：61.4℃；e05表示：59℃；f05表示：57℃；g05表示：55.7℃；h05表示53℃。
24.图3为本发明实施例5验证试剂盒中的引物和特异性探针以及检测方法的灵敏度
实验结果示意图；其中，a07表示：2
×
104copies/μl；b07表示：2
×
103copies/μl；c07表示：2
×
102copies/μl；d07表示：2
×
101copies/μl；e07表示：2
×
100copies/μl；f07表示：阴性对照组(无rna酶蒸馏水)。
具体实施方式
25.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
26.实施例1
27.本实施例提供一种用于检测鲈弹状病毒的数字pcr检测试剂盒，包括无rna酶的蒸馏水，一步法ddpcr探针法预混液，探针法ddpcr微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。
28.其中，一步法ddpcr探针法预混液包括：500μl的dna聚合酶预混液，上、下游引物分别为50μl，特异探针为50μl，引物和探针的浓度均为10μm，以及无rna酶蒸馏水300μl，总体积为950μl。
29.阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒，阴性对照为无rna酶蒸馏水。
30.引物和探针核苷酸序列分别如下：
31.f：ctgtcgcagctgaagtggag(seq id no:1)；
32.r：aggccgattgtccccatgta(seq id no:2)；
33.probe：fam
‑
tgatgaaaccaggccaagagattg
‑
mgb(seq id no:3)。
34.实施例2
35.本实施例提供一种用于检测鲈弹状病毒的数字pcr检测方法，采用实施例1的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
36.(1)提取待测样品的总rna，反转录成cdna，作为pcr反应模板。
37.(2)配制ddpcr反应液，体积20μl，其配方为：一步法ddpcr探针法预混液18μl(其中包含引物、探针和无rnase酶蒸馏水)，待测样品cdna模板为2μl。
38.(3)制备微滴，按照液滴发生板上标记位置，分别在样品孔和油位孔加入ddpcr反应液20μl和微滴发生油70μl，然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴；将液滴生成孔中生成的微滴(一般在42μl左右)以一一对应的方式全部转入96孔板，用热封仪进行封膜。
39.(4)将封好膜的96孔板转入pcr仪中进行扩增，pcr扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，59℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，4℃恒温，结束反应，每步都设置2.5℃/sec的降温速度。
40.(5)将完成pcr扩增的pcr板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中鲈弹状病毒检测结果。
41.实施例3
42.本实施例验证本发明提供的检测引物和探针的特异性，具体操作如下：
43.利用实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法，对待测病毒cdna或dna进行检测，同时设置鲈弹状病毒阳性对照组和阴性对照组(无rna酶蒸馏水)，使用的待测病毒核酸包括神经坏死病毒(nervous necrosis virus，nnv)、大口黑鲈双rna病毒(largemouth bass birnavirus，lbbv)、鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，svcv)、草
鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，gcrv)、传染性脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，isknv)、大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass virus，lmbv)。
44.实验结果如图1所示，仅阳性对照组可检测到信号，其余各组均无信号为阴性，说明本发明的引物和探针具有良好的特异性。
45.实施例4
46.本实施例对检测鲈弹状病毒的数字pcr检测方法的退火温度进行了优化，具体操作如下：
47.利用实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法，形成微滴，上pcr仪扩增，pcr的扩增程序为：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，53
‑
65℃退火60sec(仪器自动分布8个温度梯度，分别为65℃、64.3℃、63℃、61.4℃、59℃、57℃、55.7℃、53℃)，共40个循环；98℃10min结束反应。使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数。
48.实验结果如图2所示，退火温度65℃、64.3℃、63.3℃、61.4℃、59℃、57℃、55.7℃、53℃对应的拷贝数分别为10copies，0copies，11copies，79copies/μl，105copies，101copies，99copies，98copies。因此，根据结果显示选择59℃为本发明的最佳退火温度。
49.实施例5
50.本实施例验证了本发明试剂盒中的引物和特异性探针以及检测方法的灵敏度，具体操作如下：
51.本实验采用鲈弹状病毒阳性质粒进行10倍梯度连续稀释，共设置5个梯度(2
×
104copies/μl、2
×
103copies/μl、2
×
102copies/μl、2
×
101copies/μl、2
×
100copies/μl)，按照实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法进行检测。
52.实验结果如图3所示，本发明建立的ddpcr检测方法最低检出限为4copies/μl个拷贝数。
53.实施例6
54.采用ddpcr和taqman荧光定量pcr方法分别检测广东省内采集的20个大口黑鲈和鳜鱼苗种样品中的鲈弹状病毒，比较两种方法的检测准确性和灵敏度。结果如表1所示，实验数据结果表明ddpcr检测到15份阳性样品，而taqman荧光定量只检测到9份阳性样品，qpcr检测到的阳性样品ddpcr均得到一致的检查结果；在11份taqman荧光定量检测方法结果为阴性的样品中，其中ddpcr检测方法检测出6份阳性，病毒拷贝数在3.8
‑
9.8之间，实验结果表明ddpcr检测鲈弹状病毒的灵敏度更高，在检测低病毒载量的样品中更具有优势。
55.表1 ddpcr和qpcr样品检测结果
[0056][0057]
注：
‑
表示negative
‑
。
[0058]
表1的检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，与其他定量pcr检测方法相比结果更加准确可靠。
[0059]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。