一种提高月季耐热性的基因RcHSP18.1及其应用

一种提高月季耐热性的基因rchsp18.1及其应用
技术领域
1.本技术涉及植物育种领域，尤其涉及一种提高月季耐热性的基因rchsp18.1及其应用。


背景技术：

2.月季(rosa chinensis)是蔷薇科(rosaceae)蔷薇属(rosa)植物,原产我国,栽培历史约有2000年，栽培范围广泛，常应用于城市绿化、园林配置和商业生产中。月季为中国的十大名花之一，世界四大切花之首，享有“花中皇后”之美誉，是目前世界上品种最多的名贵花木之一。月季花型美观、花色绚丽、花香浓郁，且花期长、四季开花，广受市场喜爱。中国在月季花园、生产栽培、育种等各个领域都在引领风潮，目前花卉业已成为具有较大经济效益的产业，花卉品质的改变能够提高花卉的观赏价值及经济价值。
3.月季
‘
安吉拉’，诞生于德国，属于藤本月季。其枝蔓或柔软或坚硬,开花繁茂、花色艳丽，花朵小到中等，簇花，形成小集群，杯状开花形式，花期较长且多季节连续盛开，具有很高的观赏价值和良好的抗病性。近年来许多地区运用
‘
安吉拉’月季进行景观营造，上海辰山植物园自建园初期开始使用
‘
安吉拉’月季进行坡面和墙体的绿化，发现其即使在山体的北面也表现良好。受此启发，上海、杭州等各大城市的花城建设中纷纷利用
‘
安吉拉’打造花墙、市区高架及立交桥，有效改善了城市交通通道的立面景观，起到了极大的示范效果。
4.高温是制约月季夏季生长和发育的主要环境因子：夏季高温一方面会导致月季花芽停止分化，不开花，丧失观赏价值；另一方面会导致月季病虫害加重，严重影响月季的生长发育。所以研究耐热品种月季对月季经济市场的发展有至关重要的作用。因此，本领域的技术人员致力于开发一种的提高月季耐热性的基因及其应用。


技术实现要素：

5.有鉴于现有技术的上述缺陷，本技术所要解决的技术问题是如何提高月季的耐热性。
6.为实现上述目的，本技术提供了一种提高月季耐热性的基因rchsp18.1，其特征在于，所述基因rchsp18.1编码的蛋白序列如seq id no.3所示。
7.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1的编码序列如seq id no.2所示。
8.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1的序列如seq id no.1所示。
9.另一方面，本技术还提供了基因rchsp18.1在提高月季耐热性中的应用，其特征在于，所述基因rchsp18.1编码的蛋白序列如seq id no.3所示。
10.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1的编码序列如seq id no.2所示。
11.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1的序列如seq id no.1所示。
12.另一方面，本技术还提供了一种提高月季耐热性的方法，其特征在于，所述方法包括向所述月季引入基因基因rchsp18.1，所述基因rchsp18.1编码的蛋白序列如seq id no.3所示。
13.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1的编码序列如seq id no.2所示。
14.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1的序列如seq id no.1所示。
15.在某些实施方式中，所述基因rchsp18.1位于能够使其在所述月季中表达的表达载体中。
16.在某些实施方式中，所述载体为pcambia
‑
2300。
17.在某些实施方式中，所述方法包括：
18.(1)将基因rchsp18.1编码序列构建到表达载体中，所述基因rchsp18.1编码序列如seq id no.2所示；
19.(2)将含有所述基因rchsp18.1编码序列的所述表达载体转入月季中。
20.(3)筛选获得含有所述表达载体的月季植株，所述表达载体中含有所述基因rchsp18.1编码序列。
21.本技术对月季
‘
安吉拉’基因rchsp18.1的表达模式及功能进行分析，显示了其能够提高原核生物大肠杆菌de3的耐高温活性，并且在月季中过表达基因rchsp18.1也能够提高月季植株的耐热活性，为月季耐热品种改良的研究提供了便捷高效的方法，对于拓宽种质资源创新具有重要的意义。
22.以下将结合附图对本技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本技术的目的、特征和效果。
附图说明
23.图1显示的是本技术中所用材料月季
‘
安吉拉’。
24.图2显示的是本技术中rchsp18.1蛋白质三级结构预测图。
25.图3显示的是本技术中不同温度(常温(nt)28℃，高温(ht)50℃)处理2h后的月季
‘
安吉拉’叶片中rchsp18.1基因的表达分析结果图。其中nt表示常温28℃，ht表示高温50℃。
26.图4显示的是本技术中高温(50℃)处理0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min时月季
‘
安吉拉’叶片中rchsp18.1基因的表达分析结果图。
27.图5显示的是本技术中转入rchsp18.1基因的大肠杆菌de3和对照组大肠杆菌de3在常温(28℃)下的生长曲线。其中，nt表示常温，pet28a
‑
hsp18.1表示转rchsp18.1基因的重组载体pet28a菌株，pet28a
‑
ev表示pet28a空载质粒菌株。
28.图6显示的是本技术中转入rchsp18.1基因的大肠杆菌de3和对照组大肠杆菌de3在高温(50℃)下的生长曲线。其中，ht表示高温，pet28a
‑
hsp18.1表示转rchsp18.1基因的重组载体pet28a菌株，pet28a
‑
ev表示pet28a空载质粒菌株。
29.图7显示的是本技术中不同温度(常温(nt)28℃，高温(ht)50℃)处理2h后的转入了rchsp18.1基因过表达载体的月季
‘
安吉拉’和对照组月季
‘
安吉拉’愈伤组织相对电导率分析结果图。其中，ajl表示月季
‘
安吉拉’,wt表示野生型对照组，ox表示rchsp18.1基因过表达组。
30.图8显示的是本技术中不同温度(常温(nt)28℃，高温(ht)50℃)处理2h后的转入了rchsp18.1基因过表达载体的月季
‘
安吉拉’和对照组月季
‘
安吉拉’愈伤组织基因表达分析结果图。其中，wt表示野生型对照组，ox表示rchsp18.1基因过表达组。
具体实施方式
31.以下将结合实施例对本技术作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，本技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
32.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
33.在本技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等，pet28a载体(购自重庆优宝生物技术股份有限公司，产品编号：vt1207)，pcambia
‑
2300(购自重庆优宝生物技术股份有限公司，产品编号：vt1383)，大肠杆菌de3(购自重庆优宝生物技术股份有限公司，产品编号：st1007)，大肠杆菌dh5α(购自北京擎科生物科技有限公司上海分公司，产品编号：tsv
‑
a07)。
34.月季品种“安吉拉(angela)”为诞生于法国1984年的丰花藤本月季，花朵粉红色，浅粉色的亮点，中心色淡。无香或温和果香。花瓣35个，花朵平均直径4厘米，小到中等，全双(26
‑
40花瓣)，簇花，小集群，杯状开花形式，花期长，多季节连续盛开；枝条中等，浓密；叶子中等，有光泽，中绿色。高度80
‑
150厘米，最长可达300厘米；广泛种植于高架；耐旱耐热抗污染性能好。本技术的月季品种“安吉拉(angela)”购买自上海佰麟园林绿化工程有限公司。
35.实施例1月季
‘
安吉拉’rchsp18.1基因的克隆
36.提取野生型月季
‘
安吉拉’(图1)叶片总rna，提取试剂盒为steadypure plant rna extraction kit(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna。以反转录的cdna为模板，利用如seq id no.4(正向引物：5'atgtcgctcatcccaaatttcc 3')和seq id no.5(反向引物：5'ttacccggaaatttcaatggc 3')所示引物序列，pcr获得长465bp的编码区条带。其核苷酸序列如seq id no.2所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no.3所示，由154个氨基酸残基组成，分子量为19.7千道尔顿。rchsp18.1基因全长序列如seq id no.1所示。
37.实施例2月季
‘
安吉拉’rchsp18.1蛋白生物信息学分析
38.(1)选取不同物种氨基酸序列，运用mega7，分析rchsp18.1系统发育关系，rchsp18.1与兰科植物铁皮石斛，深圳拟兰聚在同一分支，归属单子叶分支。
39.(2)运用https://swissmodel.expasy.org/interactive预测rchsp18.1蛋白三级结构，如图2所示，rchsp18.1蛋白三级结构预测其形成同源二聚体发挥作用。
40.实施例3月季
‘
安吉拉’rchsp18.1基因不同温度处理后表达模式分析
41.分别提取不同温度(常温(28℃)与高温(50℃))处理后月季
‘
安吉拉’叶片中的总rna，利用反转录试剂盒将总rna反转录为cdna，进行q pcr检测，具体如下：
42.(1)自然环境培养的生长状态良好的月季
‘
安吉拉’，取其带叶茎段，在常温(28℃)与高温(50℃)处理2h。
43.(2)提取不同温度处理后
‘
安吉拉’叶片的总rna；
44.(3)利用反转录试剂盒将总rna反转录成cdna，根据seq id no.1设计引物seq id no.6和seq id no.7，进行qpcr检测。
45.正向引物：5'gtcgctcatcccaaatttcc 3'(seq id no.6)
46.反向引物：5'ttctcgccaggaaattcagg 3'(seq id no.7)
47.结果如图3所示，该基因常温下几乎不表达，但是高温胁迫下的表达量显著高于常温时的表达。
48.实施例4
‘
安吉拉’rchsp18.1基因高温处理不同时期的表达量分析
49.将月季
‘
安吉拉’生长发育良好的带叶茎段，在高温50℃下处理4h。每隔30min提取各个时期的总rna，反转录为cdna，利用引物seq id no.6和seq id no.7，进行real
‑
time pcr检测，结果如图4所示，rchsp18.1的表达量随着高温胁迫的时间延长先急剧增加，随后再不断下降。
50.实施例5
‘
安吉拉’rchsp18.1基因对原核生物耐热活性的影响分析
51.利用表达载体pet28a转入大肠杆菌de3，诱导蛋白表达后验证其耐热性，其步骤如下：
52.(1)设计引物seq id no.8和seq id no.9，利用
‘
安吉拉’cdna克隆rchsp18.1基因，构建pet28a
‑
hsp18.1表达载体；
53.正向引物：5'caaatgggtcgcggatccatgtcgctcatcccaaatttcc 3'(seq id no.8)
54.反向引物：5'tgcggccgcaagcttgtcgaccccggaaatttcaatggctttg3'(seq id no.9)
55.(2)构建分别含有载体pet28a
‑
ev和pet28a
‑
hsp18.1的大肠杆菌de3菌株。
56.(4)新摇菌液od至1.0，稀释50倍测常温28℃下生长曲线；
57.(5)od为1的新鲜菌液加入iptg至终浓度为1mm/l，高温50℃下培养，测生长曲线。
58.结果如图5和图6所示，将月季
‘
安吉拉’rchsp18.1基因转入原核生物大肠杆菌de3中后，与转入空载体pet28a
‑
ev的对照组相比，常温下rchsp18.1基因不影响大肠杆菌的生长活性(图5)，但是在高温情况下，能够增强大肠杆菌的耐热活性(图6)。
59.实施例6
‘
安吉拉’rchsp18.1基因对月季耐热活性的影响分析
60.(1)设计引物seq id no.10(5'ggatcctctagaactagtcatgtcgctcatcccaaatttcc 3')和seq id no.11(5'gtcagaaggcctcccgggccccggaaatttcaatggctttg 3')，利用
‘
安吉拉’cdna克隆rchsp18.1基因编码序列，将获得rchsp18.1基因编码序列构建到载体pcambia
‑
2300中，得到pcambia
‑
2300
‑
hsp18.1过表达载体。
61.(2)取安吉拉新鲜幼嫩叶片，加入纯水和少量洗洁精，摇床100rpm左右摇30
‑
45min，随后冲洗干净，在超净台中经过75％酒精处理45s，12.5％次氯酸钠处理6
‑
10min，无菌水清洗3
‑
5次，切割成0.2cm宽的叶片，接种到外植体诱导愈伤培养基(b)中，经过2
‑
3周生长出新鲜幼嫩的愈伤组织；b培养基配方：ms+30g/l葡萄糖+3mg/l 2,4
‑
d+0.05mg/l kt+2.7g/l植物凝胶。
62.(3)提取表达载体质粒(浓度需达到1μg/μl)，利用基因枪将表达载体转入新鲜的月季
‘
安吉拉’的愈伤组织，随后接种到愈伤增殖培养基(c)中，c培养基配方：ms+30g/l葡萄糖+2mg/l naa+0.01m.g/l 6
‑
ba+2.7g/l植物凝胶。
63.(4)先增殖1
‑
2代，随后转入筛选培养基(s)中进行筛选，获得转基因愈伤组织；s培养基配方：ms+30g/l葡萄糖+20mg/l潮霉素+2mg/l naa+0.01m.g/l 6
‑
ba+2.7g/l植物凝胶。
64.(5)在温度28℃组培室中，月季
‘
安吉拉’愈伤组织经筛选培养基筛选后，转入增殖培养基中培养20
‑
30d。
65.(6)以野生型(不作转基因处理的愈伤组织)作为对照，分别取其野生型以及过表达基因型的新鲜愈伤组织进行实验；
66.(6)分别在常温(28℃)与高温(50℃)处理2h，取部分愈伤组织材料检测其相对电导率值以及基因rchsp18.1表达量。
67.(7)检测其相对电导率值：
68.①
每个处理样本取0.2g愈伤组织，3个重复；
69.②
加入10ml ddh2o，抽真空；
70.③
静置30min；
71.④
检测各样本电导率值a；
72.⑤
沸水浴煮沸20min；
73.⑥
检测各样本电导率值b；
74.⑦
相对电导率＝a*b
‑
1*100％
75.(8)基因rchsp18.1表达量：
76.①
提取两个处理样本的总rna。
77.②
利用反转录试剂盒将总rna反转录成cdna，利用seq id no.6和seq id no.7，进行qpcr检测。
78.正常的植物细胞，其细胞膜对物质具有选择透过性，但当植物处于高温、干旱、盐胁迫等逆境条件下，细胞膜通透性会由于细胞膜被破坏而增大，从而导致细胞内的电解质外渗，使得测得的电导值增加。根据高温胁迫后植物的相对电导率和正常情况下植物的相对电导率的差值变化，可得出高温胁迫下不同月季品种的抗逆性强弱。结果显示，将含有rchsp18.1基因的过表达载体转入月季
‘
安吉拉’的愈伤组织中，经过常温或高温处理后，高温情况下的rchsp18.1基因的表达量增强(图8)；与野生型相比，高温处理后rchsp18.1过表达基因型显相对电导率著降低(图7)，证明rchsp18.1基因的过表达显著增强了月季
‘
安吉拉’的耐热活性。
79.以上详细描述了本技术的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本技术的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本技术的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。