瑞香狼毒中的愈创木烷型倍半萜类化合物及其应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及从植物瑞香狼毒中制备的新愈创木烷型半萜类化合物及其在治疗神经退行性疾病方面的应用。


背景技术：

2.瑞香狼毒(stellerachamaejasme l.)又名断肠草，是瑞香科(thymelaeaceae)狼毒属多年生草本植物，主要分布于我国西北、东北、河北、内蒙古及尼泊尔等地，资源十分丰富。瑞香狼毒的根中富含瑞香烷型二萜、黄酮、木脂素和香豆素等化合物，而倍半萜类化合物的含量较少。据国内外对瑞香狼毒的报道，该植物具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、杀虫、抗惊厥和免疫调节等药理活性。
3.炎症(inflammation):机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症分为两类，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。
4.神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)与炎症：神经退行性疾病是由于大脑和脊髓的神经元丧失而引起的一类不可逆转的神经系统疾病，特征表现为发作迟缓和选择性神经元的功能障碍。大脑中的慢性炎症环境是阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的标志。许多证据都表明炎症在神经退行性疾病的发生中占有重要的地位。固有免疫系统是在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能。与机体另一种特异性免疫应答相比，它能对各种有害物质进行迅速的反应，以保护机体。固有免疫系统本身的激活是一把双刃剑。有害物质(如聚集形式的aβ)长期和不可控制的刺激，启动固有免疫系统，就会产生对大脑的损害作用。


技术实现要素：

5.本发明提供两种从瑞香科(thymelaeaceae)狼毒属(stellera linn.)植物瑞香狼毒(stellerachamaejasme l.)中提取分离得到的新愈创木烷型倍半萜类化合物或其在药学上可接受的盐。所述化合物结构为：
[0006][0007]
本发明的从瑞香狼毒中制备所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0008]
(1)取干燥的瑞香狼毒根以乙醇提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得馏分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统按体积比100:0
–
0:100进行梯度洗脱，共收集到6个馏分fr.a
–
fr.f；
[0009]
(2)馏分fr.b经hp-20柱和ods开放柱色谱，分别以甲醇-水系统按体积比10:90
–
90:10进行梯度洗脱，得4个馏分fr.b1
–
b4；
[0010]
(3)馏分fr.b3经硅胶柱色谱以石油醚-二氯甲烷系统按体积比50:1
–
50:50在tlc分析的基础上得到4个亚馏分fr.b3a
–
fr.b3d；
[0011]
(4)在制备型反相高效液相色谱上使用乙腈-水的流动相来分离fr.b3c得到了化合物1和化合物2。
[0012]
其中，所述步骤(1)中，乙醇为70-80％工业乙醇，提取为乙醇回流提取，提取2-3次，每次2-4小时。
[0013]
所述步骤(1)中所述的瑞香狼毒为瑞香科(thymelaeaceae)狼毒属(stellera linn.)植物瑞香狼毒(stellerachamaejasme l.)。
[0014]
所得化合物经过系统结构鉴定结果如下，对应谱图如图1-15所示：
[0015]
利用高分辨质谱，一维nmr、二维nmr及计算ecd技术对化合物1
–
2的结构鉴定。
[0016]
stellerasespene c(1)：无色针状结晶(甲醇)，易溶于甲醇，二氯甲烷试剂；5％香草醛显蓝色。hresims给出准分子离子峰[m+na]
+
m/z 271.1309(calcd for c
15h20
o3na,271.1305)，结合1h-nmr，
13
c-nmr和hsqc谱推测其分子式为c
15h20
o3，计算不饱和度为6。
[0017]1h-nmr(400mhz,cdcl3)中，δ
h 5.69(1h,d,j＝1.5hz,h-9)推测为双键上的质子信号，δ
h 5.32(1h,t,j＝2.4hz,h-12a),5.15(1h,t,j＝2.0hz,h-12b)推测为一组末端双键上的氢信号，δ
h 4.65(2h,dd,j＝2.4,2.0hz,h-13)推测为一组连氧亚甲基的氢信号，δ
h 2.10(1h,dd,j＝12.0,11.3hz,h-6β),1.93(1h,d,j＝12.0hz,h-6α)推测为一组磁不等同亚甲基的氢信号，δ
h 1.82(3h,d,j＝1.5hz,h-14),0.90(3h,d,j＝7.0hz,h-15)推测为两个甲基的氢信号。
13
c-nmr(100mhz,cdcl3)显示15个碳信号，低场区显示出δ
c 152.3(c-10),124.6(c-9),154.2(c-11),107.4(c-12)推测为两组双键碳信号，包括一组末端双键的碳信号，δ
c 115.6(c-8),94.7(c-1),74.4(c-7)推测为三个连氧碳信号，在高场区δ
c 14.4(c-15),12.4(c-14)推测为两个甲基碳信号。通过hsqc谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。
[0018]
在hmbc谱中，h-2(δ
h 1.84)与c-5(δ
c 36.4)有相关，h-3(δ
h 1.71)与c-1(δ
c 94.7),c-4(δ
c 36.7)有相关，h
3-15(δ
h 0.90)与c-3(δ
c 33.5),c-4(δ
c 36.7),c-5(δ
c 36.4)有相关，得到片段a。h-6(δ
h 2.10)与c-1(δ
c 94.7),c-8(δ
c 115.6),c-11(δ
c 154.2)有相关，h-9(δ
h 5.69)与c-1(δ
c 94.7)有相关，h
3-14(δ
h 1.82)与c-1(δ
c 94.7),c-9(δ
c 124.6),c-10(δ
c 152.3)有相关，h
2-13(δ
h 4.65)与c-7(δ
c 74.4),c-8(δ
c 115.6)有相关，h
2-12(δ
h 5.32,5.15)与c-7(δ
c 74.4),c-11(δ
c 154.2),c-13(δ
c 71.1)有相关，可以得到片段b；且h
2-2(δ
h 1.84,1.80)与c-10(δ
c 152.3)的相关峰表明片段a和b是通过c-1-c-5骈合起来的。此外，根据该化合物的分子量以及c-1和c-11的化学位移c-1(δ
c 94.7)/c-8(δ
c 115.6)，推测c-1和c-11通过一个氧桥相连。据以上相关信息建立了该化合物的平面结构，推测化合物1为一个愈创木烷型倍半萜类化合物。
[0019]
由于noesy谱图中信号重叠严重，无法提供有效信息，手性中心c-1/c-4/c-5/c-7/c-8的相对构型无法通过noesy谱进行判断。但好在我们得到了该化合物的结晶，利用x-单晶衍射的方法确定了该化合物的绝对构型为1r,4s,5s,7s,8r。
[0020]
通过以上信息，确定了该化合物的结构，将其命名为stellerasespene c。
[0021]
化合物1的1h(400mhz)与
13
c(100mhz)nmr数据(cdcl3)
[0022][0023]
stellerasespened(2)：淡黄色油状物(二氯甲烷)，易溶于甲醇，二氯甲烷试剂；5％香草醛显蓝色。hresims给出准分子离子峰[m+na]
+
m/z287.1253(calcd for c
15h20
o4na,287.1254)，结合1h-nmr，
13
c-nmr以及hsqc谱推测其分子式为c
15h20
o4，计算不饱和度为6。
[0024]1h-nmr(400mhz,cdcl3)中，δ
h 5.38(1h,s,h-9)推测为双键上的氢信号，δh4.57(1h,ddd,j＝10.6,2.7,1.7hz,h-12β),3.92(1h,dd,j＝10.6,3.1hz,h-12α),4.36(1h,dd,j＝11.3,2.8hz,h-13α),4.01(1h,dd,j＝11.3,7.3hz,h-13β)推测为两组连氧亚甲基上两个磁不等同的氢信号，δ
h 2.25(3h,s,h-14),0.97(3h,d,j＝6.5hz,h-15)推测为两个甲基的氢信号。
13
c-nmr(100mhz,cdcl3)显示15个碳信号，低场区显示出δ
c 205.9(c-8),187.9(c-10),102.9(c-9)的碳信号，推测为一组α,β-不饱和羰基碳信号，δ
c 109.3(c-1),91.7(c-7),63.0(c-13),59.7(c-12)为四个连氧碳信号，高场区δ
c 18.3(c-15),17.2(c-14)为两个甲基碳信号。通过hsqc谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。
[0025]
在hmbc谱图中，h-2(δh1.98)与c-4(δ
c 40.9),c-5(δ
c 53.6)有相关，h-3(δ
h 1.25)与c-1(δ
c 109.3)有相关，h
3-15(δ
h 0.97)与c-3(δ
c 32.6),c-4(δ
c 40.9),c-5(δ
c 53.6)有相关，得到片段a。h-6(δ
h 2.01)与c-8(δ
c 205.9)有相关，h-9(δ
h 5.39)与c-7(δ
c 91.7),c-8(δ
c 205.9)有相关，h-14(δ
h 2.25)与c-9(δ
c 102.9),c-10(δ
c 187.9)有相关，同时，考虑到c-10(δ
c 187.9)不同寻常的化学位移值推测c-10与一个氧相连，因此可以得到的片段b；h-12(δ
h 4.57)/h-13(δ
h 4.01)与c-11(δ
c 36.6),c-1(δ
c 109.3)有相关，h-12(δ
h 4.57)与c-13(δ
c 63.0)有相关，同时考虑到c-1/c-12/c-13的化学位移值(δ
c 109.3/59.7/63.0),推测c-1位连有一个二氧六环的片段c。h
2-6(δ
h 2.01)与c-1(δ
c 109.3)和c-4(δ
c 40.9)的相关峰，表明片段a和b是通过c-5连接起来的。h-11(δ
h 1.90)与c-6(δ
c 33.0)有相关，h
2-12(δ
h 4.57,3.92)/h
2-13(δ
h 4.36,4.01)与c-7(δ
c 91.7)有相关，推测片段c与片段b通过c-7相连。据以上相关信息建立了化合物2的平面结构，推测化合物2为一个愈创木烷型倍半萜类化合物。
[0026]
化合物2的相对构型是通过其noesy谱并结合计算核磁确定的。h
3-15(δ
h 0.97)与和h-3β(δ
h 1.75)有相关，h-3α(δ
h 1.25)和h-5(δ
h 1.86)有相关，推测h-4/h-5位于同侧。c-1位与c-11位由于有相同的取代基，不是手性中心，而c-7位的相对构型则是通过计算核磁确定的,线性相关分析和dp4+统计分析均指向(4s*,5s*,7s*)-2b具有极大可能为该化合物的相对构型。从以上结果推测，该化合物的相对构型应为4s*,5s*,7s*。
[0027]
化合物2的绝对构型是通过计算ecd的方法确定的。该化合物的实测ecd曲线与
(4s,5s,7s)-2的计算ecd曲线具有高度的相似性，因此，推测该化合物的绝对构型为4s,5s,7s。
[0028]
通过以上信息，确定了该化合物的结构，将其命名为stellerasespene d。
[0029]
化合物2的1h(400mhz)与
13
c(100mhz)nmr数据(cdcl3)
[0030][0031]
本发明还提供一种药物组合物，包括所述的愈创木烷型倍半萜类化合物、该化合物在药学上可接受的盐、药学上可接受的赋形剂或/和载体。
[0032]
本发明还提供瑞香狼毒根提取物在治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的应用。
[0033]
本发明还提供所述愈创木烷型倍半萜类化合物在治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的用途。
[0034]
对本发明所述的倍半萜类化合物进行了抗神经炎症作用的考察。体外细胞测试的模型为脂多糖(lps)诱导的小鼠小胶质细胞bv-2细胞。测试浓度为10μm，阳性对照为米诺环素。结果显示所述化合物在测试浓度下对lps诱导的炎症反应均有抗炎作用。故本发明所述的新的愈创木烷型倍半萜类化合物具有治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的医药用途。
[0035]
本发明的优点在于，所述化合物均为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其神经细胞保护活性强，具有进一步开发的价值。
附图说明
[0036]
图1化合物1的uv谱；
[0037]
图2化合物1的hr-esims谱；
[0038]
图3化合物1的cd谱；
[0039]
图4化合物1的1h-nmr谱(600mhz,cdcl3)；
[0040]
图5化合物1的
13
c-nmr谱(150mhz,cdcl3)；
[0041]
图6化合物1的hsqc谱(600mhz,cdcl3)；
[0042]
图7化合物1的hmbc谱(600mhz,cdcl3)；
[0043]
图8化合物2的uv谱；
[0044]
图9化合物2的hr-esims谱；
[0045]
图10化合物2的cd谱；
[0046]
图11化合物2的1h-nmr谱(400mhz,cdcl3)；
[0047]
图12化合物2的
13
c-nmr谱(100mhz,cdcl3)；
[0048]
图13化合物2的hsqc谱(600mhz,cdcl3)；
[0049]
图14化合物2的hmbc谱(600mhz,cdcl3)；
[0050]
图15化合物2的noesy谱(600mhz,cdcl3)。
具体实施方式
[0051]
实施例1
[0052]
本发明所述的愈创木烷型倍半萜类化合物1-2的制备方法，包括如下步骤：
[0053]
(1)取干燥的瑞香狼毒根(50.0kg)以75％乙醇回流提取2次，每次2-4h，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得馏分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇按体积比100:0,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1,0:100进行梯度洗脱，共收集到6个馏分fr.a
–
fr.f。
[0054]
(2)馏分fr.b经hp-20柱和ods开放柱色谱，分别以甲醇-水按体积比10:90,30:70,50:50,70:30,90:10进行梯度洗脱，得4个馏分fr.b1
–
b4。
[0055]
(3)馏分fr.b3经硅胶柱色谱以石油醚-二氯甲烷按体积比50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1在tlc分析的基础上得到4个亚馏分fr.b3a
–
fr.b3d。
[0056]
(4)在制备型反相高效液相色谱上使用乙腈-水按体积比52:48的流动相来分离fr.b3c得到了化合物1(9.2mg)和化合物2(4.8mg)。
[0057]
实施例2
[0058]
化合物1-2在体外抑制lps诱导的小鼠小胶质细胞bv-2细胞炎症作用的考察。
[0059]
用griess法检测lps诱导的bv-2细胞内的no产物含量。bv-2细胞系置于含10％胎牛血清以及1％双抗的dmem培养基内，37℃，5％co2的培养箱中进行培养。稳定传代培养至对数生长的细胞用于实验。取对数生长期的bv-2小胶质瘤细胞以5
×
103个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞生长至60％时加入10μm的受试化合物，共培养1h后观察细胞生长状态良好，加入10μg/ml的lps，24h后取上清液用no试剂盒检测no浓度。利用紫外分光光度计(thermo scientific multiskan mk3，上海，中国)在540nm处测定吸光度。结果显示，化合物1-2均表现出显著的抗炎作用。
[0060]
comp.no产物(μm)11.3
±
0.96*21.7
±
0.78*mino2.5
±
0.31**lps5.2
±
0.02
###
[0061]
对照组相比于模型组的no产物浓度
###
p《0.001；实验组相比于模型组的no产物浓度*p《0.1,**p《0.05,***p《0.001。