一种花生转录因子AhbHLH10基因及其克隆与功能表达方法与流程

一种花生转录因子ahbhlh10基因及其克隆与功能表达方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程领域，更具体地说，它涉及一种花生转录因子 ahbhlh10基因及其克隆与功能表达方法。


背景技术：

2.我国是世界花生生产大国，花生种植面积居世界第二位，总产量占世界花生总产量的40％以上，居世界第一位。但是，花生产业的进一步发展受到旱灾的威胁。据统计，我国每年因干旱引起的花生减产达30％～50％。除产量下降外，干旱还有可能导致花生被黄曲霉毒素污染、品质下降等一系列后果。此外，随着粮食种植面积红线意识的增强，如何避免粮油挣地，在逆境胁迫下保持甚至增加花生的产量，成为科学研究的一个方向。
3.目前，利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了巨大进步。当胁迫信号产生后，花生会启动一系列相应信号，最后传导到相关基因，启动该基因表达以协助花生适应或抵御逆境。转录因子是调控这些基因表达的重要因素，转录因子是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的dna结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，调控基因的表达。
4.bhlh是存在于真核生中最广泛的一类转录因子家族，也是植物中最大转录因子家族之一，可以通过与靶基因中特定的基序结合来调控基因的表达.该转录因子包含保守的bhlh结构域，由一个位于n端的碱性区域和一个位于c 端的α螺旋结构组合而成。碱性区域是该转录因子与靶基因的识别区域，含有大量的碱性氨基酸，能与靶基因中保守的六核苷酸e
‑
box结合,调控它们的表达，行使生物学功能(沈方圆等,2021)。2003年，拟南芥中鉴定出162个成员，被分为21个亚家族(toeldo et al,2003)，2006年，li等人(li etal,2006)从水稻中鉴定到了167个成员，分为22个亚家族。在植物中，bhlh 是仅次于myb类的第二大转录因子家族，其家族成员广泛参与植物的新陈代谢、活性成分合成、金属离子内稳态以及信号激素调节等重要生物学过程，还在植物的生长发育和环境应激中扮演着重要角色(王静等,2019)。到目前为止，尚未发现花生中bhlh10基因的研究报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种花生转录因子ahbhlh10基因，第二个目的在于提供一种花生转录因子ahbhlh10基因的克隆与功能表达方法。
6.为实现上述第一个目的，本发明提供了一种花生转录因子ahbhlh10基因，所述ahbhlh10基因开放阅读框为1503bp，共编码500个氨基酸。
7.进一步地，所述ahbhlh10基因的全长核苷酸序列是序列表中sequencelisting 1，所述ahbhlh10基因的氨基酸序列是序列表中sequence listing 2。
8.为实现上述第二个目的，本发明提供了一种花生转录因子ahbhlh10基因的克隆与功能表达方法，其技术方案为：
ahbhlh10
‑
cdsf1和8μl无菌双蒸水；
28.开放阅读框pcr扩增反应条件：(a)94℃，5min；(b)94℃，1min； 55℃，1min；72℃，4min；共30cycles；(c)72℃，10min。
29.一种花生转录因子ahbhlh10基因的功能表达方法为使用荧光定量rt
‑
pcr 对ahbhlh10基因干旱下的表达进行分析，蘸花法(liu et al.2015)将 ahbhlh10基因转入拟南芥验证基因功能。
30.进一步地，所述荧光定量rt
‑
pcr所用cdna模板稀释到8ng/μl，使用的聚合酶是sybr green，采用的仪器是7500fast荧光定量pcr仪，每反应体系加 2μl稀释的cdna；
31.rt
‑
pcr反应程序为：(a)95℃，10s；(b)95℃，5s；(c)60℃，30s；(d)72℃，10s；40个循环；绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10s增加0.5℃， rt
‑
pcr的内参基因为actin。
32.进一步地，所述的ahbhlh10荧光定量rt
‑
pcr所用的引物序列为：
33.ahbhlh10
‑
r：5
’‑
ccttctattatcttgctatt
‑3’
和
34.ahbhlh10
‑
f:5
’‑
tgttgatgatgatgttac
‑3’
。
35.进一步地，所述内参基因actin所用引物序列为：
36.actin
‑
f:5
’‑
gaggagaagcagaagcaagttg
‑3’
和
37.actin
‑
r:5
’‑
agacagcatatcggcactcatc
‑3’
。
38.综上所述，本发明具有以下有益效果：
39.1、本发明公开了一种花生转录因子ahbhlh10基因，该基因在干旱胁迫处理后相对表达量一直处于上升趋势，表明该基因在花生对干旱胁迫的适应性中具有重要作用。
40.2、本发明公开的一种花生转录因子ahbhlh10基因，通过转基因手段导入拟南芥中，在干旱胁迫状态下，野生型植株叶片瘦小、植株萎缩，而转基因植株叶片厚实、植株壮大、生命力旺盛，转基因植株具有明显的抗旱表型，且转基因植株mda含量为野生型植株的86％，sod、pod、cat含量分别为野生型植株的115％、120％和142％，从而说明转基因植株的抗旱性显著高于野生型植株，说明ahbhlh10基因具有显著的抗旱性，进而ahbhlh10基因能提高花生的抗旱性，增强花生的抗逆性。
附图说明
41.图1是本发明花生ahbhlh10蛋白与其他花生中bhlh10类蛋白氨基酸序列比较；
42.图2是花生ahbhlh10基因在干旱胁迫下的表达模式分析；
43.图3是拟南芥超表达ahbhlh10基因在干旱胁迫下的表型；
44.图4是转基因拟南芥干旱胁迫关键生理指标。
具体实施方式
45.以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，但并不是对本发明的进一步限定。
46.实施例1花生转录因子ahbhlh10基因的克隆
47.s1、材料的准备与处理，包括花生种子的萌发、生长以及干旱胁迫处理。
48.材料选择花生品种花育71，种子在hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为25
‑
28℃，幼苗生长14天用于干旱胁迫处理；干旱胁迫用peg6000处理，花生根浸泡在20％peg6000溶液中，在处理 48h后取花生的叶片作为材料，所
有材料均保存于
‑
80℃超低温冰箱中备用。
49.s2、花生幼苗的dna、rna的提取和cdna的合成。
50.用takara的takaraminibestplantgenomicdnaextractionkit提取dna，minibestuniversalrnaextractionkit试剂盒分离提取花生幼苗rna，将得到的rna去除dna污染后再进行cdna合成。用primescript
tm
ii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒进行cdna合成，之后将反转录产物于
‑
20℃低温冰箱中保存备用，以上所用器皿都需经过去除rna酶处理。器皿用0.1％的depc浸泡12小时，然后高压灭菌去除。溶液试剂用0.1％的depc处理(37℃放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用depc
‑
h2o配制。
51.s3、通过pcr进行全长ahbhlh10基因克隆。
52.扩增基因全长所用引物为：
53.ahbhlh10
‑
f1：5
’‑
tgagcatgtacgtggacccc
‑3’
；
54.ahbhlh10
‑
r1：5
’‑
cgtacaagtaactacttgttctttggtg
‑3’
。
55.pcr克隆产物经过2％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化。纯化产物与puc18载体连接后转化至感受态大肠杆菌中，lb培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液pcr扩增预检测是否有插入片段并测序。扩增引物为：
56.m13r：5
’‑
cacacaggaaacagctatgac
‑3’
和
57.m13f：5
’‑
cgccagggttttcccagtcacgac
‑3’
。
58.全长pcr扩增所用聚合酶为gxldnapolymerase，全长pcr扩增反应体系包含10μlbuffer、4μldntp、1μlgxl、2μl总cdna、1.5μlahbhlh10
‑
f1、ahbhlh10
‑
r1和30μl无菌双蒸水；全长pcr扩增反应条件如下：(a)98℃，10s；(b)55℃，15s；共30cycles；(c)68℃，2min。
59.s4、通过rt
‑
pcr进行开放阅读框克隆。
60.反转录所用试剂盒为takara的primescript
tm
ii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒，rt
‑
pcr扩增基因开放阅读框所用引物为：
61.ahbhlh10
‑
cdsf1：5
’‑
atgcatgagcaacctggtt
‑3’
；
62.ahbhlh10
‑
cdsr1：5
’‑
ctaatagctacttgtatgtggaactgc
‑3’
。
63.pcr克隆产物经过2％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化。纯化产物与puc18载体连接后转化至感受态大肠杆菌中，lb培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液pcr扩增预检测是否有插入片段并测序。扩增引物为：
64.m13r：5
’‑
cacacaggaaacagctatgac
‑3’
和
65.m13f：5
’‑
cgccagggttttcccagtcacgac
‑3’
。
66.开放阅读框克隆所用聚合酶为takarapcrmix，在20μl体系中加入以下成分：10μltakarapcrmix、1μl总cdna、0.5μlahbhlh10
‑
cdsr1、0.5μlahbhlh10
‑
cdsf1和8μl无菌双蒸水；
67.开放阅读框pcr扩增反应条件：a)94℃，5min；(b)94℃，1min；55℃，1min；72℃，4min；共30cycles；(c)72℃，10min。
68.实施例2ahbhlh10基因序列信息与特征分析
69.ahbhlh10基因全长为1845bp，开放阅读框为1503bp，共编码500个氨基酸。如图1所示，ahbhlh10基因的氨基酸序列在ncbi网站上通过blast分析后发现该基因氨基酸序列与
spatholobus suberectus的bhlh10蛋白 (tky59715.1)的相似性为82.48％，与mucuna pruriens相关蛋白(rdx80453.1) 的相似性为81.64％。ahbhlh10基因的全长核苷酸序列是序列表中sequencelisting 1；ahbhlh10基因的氨基酸序列是序列表中sequence listing 2。
70.实施例3 ahbhlh10基因的功能表达
71.使用荧光定量rt
‑
pcr对ahbhlh10基因干旱下的表达进行分析，蘸花法(liuet al.2015)将ahbhlh10基因转入拟南芥验证基因功能。
72.荧光定量rt
‑
pcr所用cdna模板稀释到8ng/μl，用的聚合酶是sybrgreen，采用的仪器是7500fast荧光定量pcr仪，每反应体系加2μl稀释的cdna；pcr反应程序如下：(a)95℃，10s；(b)95℃，5s；(c)60℃， 30s；(d)72℃，10s；40个循环；绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10s 增加0.5℃，rt
‑
pcr的内参基因为actin。
73.ahbhlh10荧光定量用的引物序列为：
74.ahbhlh10
‑
r：5
’‑
ccttctattatcttgctatt
‑3’
和
75.ahbhlh10
‑
f:5
’‑
tgttgatgatgatgttac
‑3’
。
76.内参基因actin所用引物序列为：
77.actin
‑
f:5
’‑
gaggagaagcagaagcaagttg
‑3’
和
78.actin
‑
r:5
’‑
agacagcatatcggcactcatc
‑3’
。
79.通过荧光定量rt
‑
pcr验证了ahbhlh10基因在干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因干旱胁迫下转录水平均有明显升高。从图2可以看出，该基因在干旱胁迫处理后相对表达量一直处于上升的趋势，从而表明ahbhlh10基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。从图3可以看出，将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，在正常状态下，野生型和转基因植株均叶片嫩绿，表型良好；在干旱胁迫状态下，野生型植株叶片瘦小、植株萎缩，而转基因植株叶片厚实、植株壮大、生命力旺盛，转基因植株具有明显的抗旱表型；如图4 所示，wt为野生型拟南芥，t3
‑
1、t3
‑
2为转基因拟南芥的2个株系；拟南芥转基因植株mda含量为野生型植株的86％，sod、pod、cat含量分别为野生型植株的115％、120％和142％，从而说明转基因植株的抗旱性显著高于野生型植株，说明ahbhlh10基因具有显著的抗旱性，进而ahbhlh10基因能提高花生的抗旱性。
80.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
81.82.83.。