利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法与流程

文档序号:27514689发布日期:2021-11-22 17:48阅读:565来源:国知局
利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法与流程

1.本发明涉及核酸检测领域,涉及利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法,具体涉及利用cas蛋白进行核酸检测的方法,所述检测方法中的检测器为双链核酸检测器。


背景技术:

2.特异性检测核酸分子(nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值,例如病原体的检测,遗传病检测等。在病原体检测方面,由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列,因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测,也称为核酸诊断(nads,nucleic acid diagnostics),在食品安全、环境微生物污染检测,人体病原菌感染等领域具有重要义。
3.目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步,第一步是目的核酸的扩增,第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、southern、northern、斑点杂交、荧光pcr检测技术、lamp环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(rpa)等方法。
4.2012年之后,crispr基因编辑技术兴起,张锋团队基于rpa技术开发了一种以cas13为核心的靶向rna的新核酸诊断技术(sherlock技术),doudna团队开发了一种以cas12酶为核心的诊断技术(detectr技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于cas12的新型核酸检测技术(holmes技术)。基于crispr技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。申请人基于cas12i和cas12j也开发了相应的核酸检测体系,例如,中国专利申请(cn111996236a,公开日:2020年11月27日)公开了基于cas12i和cas12j的核酸检测方法,但是,上述方法中所利用的检测器均是单链核酸;本技术对上述检测方法中的检测器进行了改进,提出了一种利用双链核酸作为检测器进行核酸检测的方法。


技术实现要素:

5.本发明提供了一种基于crispr技术进行核酸检测的方法、组合物、系统和试剂盒,尤其提供了一种利用优化的核酸检测器进行靶核酸检测的方法、组合物、系统和试剂盒。
6.一方面,本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法,所述方法包括将样品与crispr效应蛋白、grna(指导rna)和核酸检测器接触,所述grna包括与所述crispr效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列;检测由crispr效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号,从而检测靶核酸,所述核酸检测器不与所述grna杂交;
7.所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸;所述crispr效应蛋白选自mad7或lbcas12a。
8.所述mad7记载在专利申请(cn111511906a,公开日期:20200807中),在其他的实施方式中,所述mad7还可以包括mad7的突变体或直向同源物,例如,us10704033b1中记载的mad7的直向同源物mad7v1、mad7v2、mad7v3和mad7v4,以及us10604746b1中记载的mad7的突
变体mad70系列蛋白(us10604746b1的seq id no.8、9、10或15所示)。
9.本发明中,所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸;在一个实施方式中,所述核酸检测器为单链核酸,所述单链核酸具有反向重复序列,所述反向重组序列可以通过碱基互补配对形成双链互补配对结构;在其他的实施方式中,所述互补配对结构由双链核酸互补配对形成;在一个实施方式中,所述核酸检测器的核酸为双链核酸。所述单链核酸或双链核酸的核酸为dna或rna。
10.另一方面,本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物,所述系统或组合物包括上述crispr效应蛋白、grna(指导rna)和核酸检测器。
11.另一方面,本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒,所述试剂盒包括上述crispr效应蛋白、grna(指导rna)和核酸检测器。
12.另一方面,本发明还提供了上述系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。
13.另一方面,本发明还提供了上述系统或组合物在制备检测样品中靶核酸的试剂或试剂盒中的应用。
14.另一方面,本发明还提供了一种切割非靶核酸的方法,所述方法包括,使核酸群体与crispr效应蛋白和grna接触,所述核酸群体包含靶核酸和多个非靶核酸,所述grna包括与所述crispr效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列;所述crispr效应蛋白切割所述非靶核酸,所述非靶核酸包括可以形成双链互补配对结构的核酸,所述非靶核酸不与所述grna杂交;所述crispr效应蛋白选自mad7或lbcas12a。
15.所述接触可以是在体外、离体或体内的细胞内部。
16.优选的,所述切割非靶核酸为非特异性的切割所述非靶核酸。
17.所述非靶核酸包括可以形成双链互补配对结构的核酸;在一个实施方式中,所述非靶核酸为单链核酸,所述单链核酸具有反向重复序列,所述反向重组序列可以通过碱基互补配对形成双链互补配对结构;在其他的实施方式中,所述互补配对结构由双链核酸互补配对形成;在一个实施方式中,所述非靶核酸为双链核酸。
18.另一方面,本发明还提供了上述crispr效应蛋白和grna在非特异性的切割所述非靶核酸中的应用,或在制备用于非特异性的切割所述非靶核酸的试剂或试剂盒中的用途。
19.上述利用mad7或lbcas12a切割非靶核酸的方法,在实际应用时,可以用来清除不想要的非目标核酸或者污染的核酸,例如,核酸扩增时的气溶胶污染。
20.本发明中,所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸,包括单链核酸、双链核酸,例如单链dna、双链dna、单链rna、双链rna。
21.本发明中,所述可检测信号通过以下方式实现:基于视觉的检测,基于凝胶电泳检测,基于传感器的检测,颜色检测,基于金纳米颗粒的检测,荧光偏振,荧光信号检测,电化学检测和基于半导体的检测。
22.在一些实施方式中,本发明的方法还包括测量crispr效应蛋白产生的可检测信号的步骤。所述crispr效应蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发trans切割活性,从而切割所述核酸检测器进而产生可检测信号。
23.本发明中,所述可检测信号可以是当切割核酸检测器时产生的任何信号。例如,基于金纳米颗粒的检测,荧光偏振,胶体相变/分散,电化学检测,基于半导体的传感。所述可
检测信号可通过任何合适的方式读出,包括但不限于:可检测的荧光信号的测量,凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化),基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如,基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。
24.在优选的实施方式中,所述可检测信号通过以下方式实现:所述核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团,当所述核酸检测器被切割后,可以表现出可检测的报告信号;例如,核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团,当所述核酸检测器被切割后,可以表现出可检测的荧光信号。
25.在一个实施方式中,所述荧光基团选自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种或任意几种;所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种或任意几种。
26.在其他的实施方式中,所述可检测信号还可以通过以下方式实现:所述核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子,通过胶体金检测的方式检测反应信号。
27.在其他的实施方式中,所述可检测信号还可以通过凝胶电泳的方式检测:通过凝胶电泳判断所述核酸检测器是否被切割。
28.在一个实施方式中,所述的靶核酸包括dna、rna,优选为单链核酸或双链核酸。
29.在一个实施方式中,所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的,所述靶核酸为pcr、nasba、rpa、sda、lamp、had、near、mda、rca、lcr、ram等方法富集或扩增的产物。
30.在一个实施方式中,所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。
31.在一个实施方式中,所述样品包括来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等的样品。
32.在一个实施方式中,所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸,如特定的突变位点或snp位点或与对照有差异的核酸;优选地,所述病毒为植物病毒或动物病毒,例如,乳头瘤病毒,肝dna病毒,疱疹病毒,腺病毒,痘病毒,细小病毒,冠状病毒;优选地,所述病毒为冠状病毒,优选地,sars、sars

cov2(covid

19)、hcov

229e、hcov

oc43、hcov

nl63、hcov

hku1、mers

cov。
33.在一些实施方式中,所述靶核酸来源于细胞,例如,来源于细胞裂解液。
34.在一些实施方式中,所述可检测信号的测量可以是定量的,在其他的实施方式中,所述可检测信号的测量可以是定性的。
35.根据本发明的记载可知,cas12i、cas12j或cas12b是无法切割上述核酸检测器(所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸),进而应用于核酸检测的。也就是说,上述核酸检测器是mad7或lbcas12a所特异的。因此,另一方面,本发明还提供了基于不同的crispr效应蛋白和不同的核酸检测器的多重核酸检测方法、组合物、系统或试剂盒。
36.例如,cn112795625a,公开日期:20210514,公开了由两个碱基组成的单链核酸检测器对cas12i是特异的,包含锁核酸或由锁核酸组成的单链核酸检测器对cas12b是特异的,cas12j能特异性的切割由核酸类似物
‑2’
氧甲基rna组成的单链核酸检测器。
37.因此,本发明还提供了一种基于crispr技术进行多重核酸检测的方法、系统、组合物和试剂盒。
38.一方面,本发明提供了一种多重检测样品中靶核酸的方法,所述方法包括将样品
与crispr效应蛋白、grna(指导rna)和核酸检测器接触,所述grna包括与所述crispr效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列;检测由crispr效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号,从而检测靶核酸,所述核酸检测器不与所述grna杂交;所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸;所述crispr效应蛋白选自mad7或lbcas12a;
39.所述方法还包括将样品与核酸检测组合物接触,所述核酸检测组合物包括cas蛋白、grna和单链核酸检测器;所述grna包括与所述cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列;检测由cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号,从而检测靶核酸;
40.所述核酸检测组合物选自第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物、和第三核酸检测组合物的任意一种、任意两种或三种;
41.所述第一核酸检测组合物包括cas12i,可以结合cas12i以及与靶核酸上的第一靶序列杂交的第一grna,和第一单链核酸检测器;
42.所述第二核酸检测组合物包括cas12b(优选,aacas12b),可以结合cas12b以及与靶核酸上的第二靶序列杂交的第二grna,和第二单链核酸检测器;
43.所述第三核酸检测组合物包括cas12j,可以结合cas12j以及与靶核酸上的第三靶序列杂交的第三grna,和第三单链核酸检测器;
44.所述第一单链核酸检测器由两个连续的核苷酸组成;优选的,所述核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核酸类似物中的一种或几种;所述核糖核苷酸的碱基选自a、u、c、g、t、i中的一种或任意几种;所述脱氧核糖核苷酸的碱基选自a、t、c、g、u、i中的一种或任意几种。
45.优选的,所述第一单链核酸检测器的核酸为两个连续的脱氧核苷酸,所述脱氧核糖核苷酸的碱基序列为tt或ct。
46.所述第二单链核酸检测器的核酸结构为核酸类似物,所述核酸类似物为锁核酸(lna),包含锁核酸的单链核酸检测器还记载在了中国申请cn2020105609327中。所述锁核酸的碱基选自a、t、c、g、u、i中的一种或任意几种。
47.所述第三单链核酸检测器的核酸结构为核酸类似物,所述核酸类似物为2’氧甲基rna,所述2’氧甲基rna的碱基选自a、t、u、c、g、i中的一种或任意几种。
48.另一方面,本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂或系统,所述试剂或系统包括crispr效应蛋白、grna(指导rna)和核酸检测器,所述grna包括与所述crispr效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列,所述核酸检测器不与所述grna杂交;所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸;所述crispr效应蛋白选自mad7或lbcas12a;所述试剂或系统还包括选自上述第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物和第三核酸检测组合物中的任意一种、任意两种或三种。
49.另一方面,本发明还提供了上述试剂或系统在制备用于检测样品中靶核酸的试剂盒中的用途。
50.另一方面,本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒,所述试剂盒包括crispr效应蛋白、grna(指导rna)和核酸检测器,所述grna包括与所述crispr效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列,所述核酸检测器不与所述grna杂交;所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸;所述crispr效应蛋白选自mad7或lbcas12a;所
述系统还包括选自上述第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物和第三核酸检测组合物中的任意一种、任意两种或三种。
51.另一方面,本发明还提供了上述试剂、系统或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。
52.本发明中,所述grna包括靶向所述靶核酸的序列(导向序列)和识别cas蛋白(crispr效应蛋白)的序列(同向重复序列或其部分)。
53.本发明中,所述的导向序列包括10

40bp;优选地,12

25bp;优选地,15

23bp;优选地,16

18bp。
54.本发明中,所述grna与待杂交的序列至少有50%的匹配度,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%。
55.在一个实施方式中,所述cas蛋白与grna的用量摩尔比为(0.8

1.2):1。
56.在一个实施方式中,所述cas蛋白的用量终浓度为20

200nm,优选,30

100nm,更优选,40

80nm,更优选,50nm。
57.在一个实施方式中,所述grna的用量终浓度为20

200nm,优选,30

100nm,更优选,40

80nm,更优选,50nm。
58.在一个实施方式中,所述靶核酸的用量终浓度为5

100nm,优选,10

50nm。
59.在一个实施方式中,所述核酸检测器的用量终浓度为100

1000nm,优选,150

800nm,优选,200

800nm,优选,200

500nm,优选,200

300nm。
60.在一个实施方式中,所述核酸检测器为双链dna。
61.在一个具体的实施方式中,所述mad7的氨基酸序列如seq id no.1所示,所述lbcas12a的氨基酸序列如seq id no.2所示,或者与上述序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性、仍保持mad7或lbcas12a活性的蛋白。
62.术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如rna、dna)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列,即以序列特异性,反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或g/u碱基对,“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列,尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度,这是本领域公知的变量。典型地,可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如,10个核苷酸或更多,12个核苷酸或更多,15个核苷酸或更多,20个核苷酸或更多,22个核苷酸或更多,25个核苷酸或更多,或30个核苷酸或更多)。
63.应当理解,多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100%互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60%或更高,65%或更高,70%或更高,75%或更高,80%或更高,85%或更高,90%或更高,95%或更高,98%或更高,99%或更高,99.5%或更高,或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100%。
64.一般定义:
65.除非另有定义,否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
66.术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
67.术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用,包括dna、rna或者其杂交体,可以是双链或单链的。
68.术语“寡核苷酸”是指含有3

100个核苷酸的序列,优选,具有3

30个核苷酸,优选,4

20个核苷酸,更优选,5

15个核苷酸。
69.术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,氨基酸序列的同一性可以通过常规方法,参考例如smith and waterman,1981,adv.appl.math.2:482pearson&lip man,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:2444,thompsonetal.,1994,nucleic acids res 22:467380等的教导,通过计算机化运行运算法则(wisco nsin genetics软件包中的gap,bestfit,fasta,和tfasta,genetics comp uter group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(ncbi www.nc bi.nlm.nih.gov/)获得的blast运算法则,使用默认参数确定。
70.如本文所用,所述“crispr”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),其来自微生物的免疫系统。
71.如本文所用,“生物素(biotin)”也称维生素h,是一种分子量为244da的小分子维生素。“亲和素(avidin)”,又称抗生物素,是一种碱性糖蛋白,具有4个同生物素亲和例极高的结合位点,常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合,而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
72.靶核酸
73.如本文所用,所述“靶核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品,包括但不限于单细胞生物,例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等,多细胞生物(例如植物或动物,包括来自健康或表面健康的人类受试者或待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品,例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如,生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如,从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如,正常关节或受疾病影响的关节,例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体,或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本,例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于,细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。
74.在其他实施方式中,生物样品可以是植物细胞、愈伤、组织或器官(如根、茎、叶、花、种子、果实)等。
75.本发明中,所述的靶核酸还包括通过逆转录rna形成的dna分子,进一步地,所述的
靶核酸可以采用本领域公知的技术对其进行扩增,所述的扩增技术等温扩增技术和非等温扩增技术,等温扩增可以是基于核酸测序的扩增(nasba)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、环介导的等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)、解旋酶依赖性扩增(hda)、或切口酶扩增反应(near)。在某些示例性实施方式中,可以使用非等温扩增方法,其包括但不限于pcr、多重置换扩增(mda)、滚环扩增(rca)、连接酶链反应(lcr)、或衍生物扩增方法(ram)。
76.进一步的,本发明所述的检测方法还一步包括对靶核酸扩增的步骤;所述的检测系统,还进一步包括对靶核酸进行扩增的试剂。所述扩增的试剂包括下组中的一种或多种:dna聚合酶、链置换酶、解旋酶、重组酶、单链结合蛋白等。
77.cas蛋白
78.本发明所述的cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白,优选地,所述的cas蛋白为具有cis和trans切割活性的蛋白。所述的cis活性是指cas蛋白可在grna的作用下识别pam位点并特异性切割靶序列的活性。
79.在实施方式中,本文所称的cas蛋白,如cas12,也涵盖cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体),包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的v型dna靶向效应蛋白。
80.在一个实施方式中,编码cas蛋白,如cas12,的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。
81.在一个实施方式中,cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。
82.在一个实施方式中,cas蛋白可以来自:纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、parvibaculum、葡萄球菌属、nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。
83.所述的cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得,即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上,再转化到宿主细胞中,使得所述的编码核酸分子在细胞中表达,从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来,或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达,也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合,或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型,它们是本领域技术人员所熟知的,优选地,本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件,选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。
84.宿主细胞可以是原核细胞,如大肠杆菌,链霉菌属、农杆菌:或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载
体和宿主细胞。
85.grna
86.如本文所用,所述的“grna”又称为guide rna或导向rna,并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言,导向rna可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guide sequence),或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性crispr系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。grna在不同的crispr系统中,依据其所依赖的cas蛋白的不同,可以包括crrna和tracrrna,也可以只含有crrna。crrna和tracrrna可以经过人工改造融合形成single guide rna(sgrna)。在某些情况下,导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导crispr/cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列,通常具有12

25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供cas蛋白识别,以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100%互补。所述的导向序列不与单链核酸检测器互补。
87.在某些实施方案中,当最佳比对时,导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如,存在公开和可商购的比对算法和程序,诸如但不限于clustalw、matlab中的史密斯

沃特曼算法(smith

waterman)、bowtie、geneious、biopython以及seqman。
88.本发明所述的grna可以是天然的,也可以是经过人工改造或设计合成的。
89.核酸检测器
90.本发明的核酸检测器的两端包括不同的报告基团或标记分子,当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号,当该核酸检测器被切割后,呈现出可检测的信号,即切割后与切割前表现出可检测的区别。
91.在一个实施方式中,所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团,所述荧光基团选自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种或任意几种;所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种或任意几种。
92.在一个实施方式中,所述的核酸检测器具有连接至5’端第一分子(如fam或fitc)和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测特征序列(优选,胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线,在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体),在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体,在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体,如亲和素)。当反应沿着条带流动时,第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线,切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体,而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割,更多的信号将在第一捕获线处累积,并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面,本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面,本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法,例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面,所述单链核酸检测器中的分子可相互替换,或改变分子的位置,只要其报告原理与本发明相同或相近,所改进的方式也均包含在本发明中。
附图说明
93.图1.实施例中采用的具有反向重复序列的reporter所形成的双链结构示意图。
94.图2.利用不同的cas蛋白采用具有双链结构的reporter进行核酸检测的荧光结果。
95.图3.利用mad7针对具有双链结构的reporter和常规的单链reporter进行核酸检测的结果比较图。其中,线条1为具有双链结构的reporter的实验组结果,线条2为常规的单链reporter的实验组结果,线条3为具有双链结构的reporter的对照组结果,线条4为常规的单链reporter的对照组结果,对照组均不添加靶核酸。
96.图4.利用mad7对非特异性双链pcr产物的trans切割电泳图,其中,泳道1:maker;泳道2

3:mad7+ev71+grna+ostgw6;泳道4

5:mad7+ev71+ost gw6(不添加grna);泳道6

7:mad7+grna+ostgw6(不添加ev71);泳道8:ostgw6(不添加mad7、ev71、grna)。
97.图5.采用不同的具有双链结构的reporter验证mad7和cas12i的trans切割活性。
98.实施方式
99.下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
100.本发明技术方案基于如下原理,获得待测样品的核酸,比如,可以通过扩增的方法得到靶核酸,利用可以与靶核酸配对的grna引导cas蛋白识别并结合在靶核酸上;随后,cas蛋白激发双链核酸检测器的切割活性,从而切割体系里的双链核酸检测器;双链核酸检测器设置有荧光基团和淬灭基团,如果双链核酸检测器被切割,则会激发荧光;在其他的实施方式中,双链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记;在其他的实施方式中,双链核酸检测器不设置任何报告基团,可以通过凝胶电泳的方式检验双链核酸检测器是否被切割。
101.本实施方式中,所采用的cas蛋白为mad7、lbcas12a、ascas12a、aacas12b、cas12i以及cas12j。
102.所述mad7记载在专利申请(cn111511906a,公开日期:20200807中),在其他的实施方式中,所述mad7还可以包括mad7的突变体或直向同源物,例如,us10704033b1中记载的mad7的直向同源物mad7v1、mad7v2、mad7v3和mad7v4,以及us10604746b1中记载的mad7的突变体mad70系列蛋白(us10604746b1的seq id no.8、9、10或15所示)。
103.在本实施方式中,mad7、lbcas12a、ascas12a、aacas12b、cas12i以及cas12j的氨基酸序列分别如seq id no.1

6所示。
104.实施例1、利用不同的cas蛋白采用含双链结构的reporter进行核酸检测
105.本实施方式中,设计reporter序列为5
’‑
cy5

tgtcttattccaataagaca
‑3’
bhq1,该reporter由于5’和3’端具有反向重复序列,两端分别标记cy5和bhq,退火之后自身互补配对可以形成具有双链的发卡结构或者彼此配对形成的双链结构,如图1所示。
106.为了验证不同的cas蛋白能否利用上述reporter进行核酸检测,基于不同的cas蛋白涉及了grna如下:
107.表1、不同cas蛋白所针对的grna以及靶核酸
[0108][0109]
所采用的反应体系如下:反应体系中分别加入不同的cas蛋白、相应的grna、靶核酸和reporter(5
’‑
cy5

tgtcttattccaataagaca
‑3’
bhq1);其中,cas蛋白的终浓度为50nm,grna的终浓度为50nm,靶核酸的终浓度为500nm,reporter的终浓度500nm。37℃反应,在q6上20s取一次荧光;结果如图2所示;上述测试的cas蛋白中,只有mad7和lbcas12a可以利用上述reporter表现出荧光信号,从而用于核酸检测,其他的cas蛋白无法利用上述reporter进行核酸检测。
[0110]
上述结果是出乎意料的,这是因为,cas12i、cas12j、cas12a、cas12b、mad7均可以利用单链核酸检测器作为reporter(例如,5
’‑
fam

ttgtt
‑3’
bhq)进行核酸检测;但是,cas12i、cas12j、ascas12a、aacas12b却不能利用上述reporter进行核酸检测;这可能是因为上述reporter形成了含有双链核酸的结构,导致不同的cas酶表现出了不同的切割活性;这提示我们,mad7和lbcas12a可以切割双链的核酸检测器并用于核酸检测。
[0111]
另外,针对mad7和lbcas12a可以切割双链的核酸检测器的特性,我们比较了其与常规的单链核酸检测器(5
’‑
fam

ttgtt
‑3’
bhq1)的活性;结果如图3所示,利用上述含双链结构的核酸检测器的检测活性要优于常规的单链核酸检测器的检测活性。
[0112]
实施例2、利用mad7和lbcas12a切割非特异性双链核酸
[0113]
本实施方式中,对mad7和lbcas12a切割非特异性双链核酸的特性做了进一步验证。在检测体系中分别加入mad7、靶核酸ssdna、grna、非特异性dsdna;mad7的终浓度为50nm,grna的终浓度为50nm,ssdna的终浓度为500nm,dsdna的终浓度300ng。酶切30min后,凝胶电泳验证。
[0114]
本实施方式中,所选取的靶核酸为ev71,非特异性dsdna为ostgw6的pcr产物,所利用的grna可以靶向ev71,但不会靶向ostgw6。
[0115]
结果如图4所示,当反应体系中加入mad7、靶核酸ssdna、grna和非特异性dsdna,可以明显看到非特异性dsdna明显被降解;而其他对照组(不添加grna、不添加ev71或者仅采用非特异性dsdna进行电泳),非特异性dsdna没有被降解;这进一步说明了,在利用mad7的trans切割活性进行核酸检测时,可以采用双链核酸作为检测器进行核酸检测。此外,也可以利用mad7对双链核酸的trans切割作用来清除核酸扩增时候的气溶胶污染。
[0116]
实施例3、含双链结构的reporter的优化
[0117]
为了进一步优化mad7和cas12i对实施例1中的reporter的切割效果,本实施方式中,对实施例1中的具有反向重复序列的reporter(5
’‑
cy5

tgtcttattccaataagaca
‑3’
bhq1)做了进一步优化,优化后的序列如下所示:
[0118]
2c(实施例1中的reporter):cy5

tgtcttattccaataagaca

bhq1;
[0119]
3c:cy5

tgtcttatcccataagaca

bhq1;
[0120]
4c:cy5

tgtcttatccccataagaca

bhq1;
[0121]
5c:cy5

tgtcttatcccccataagaca

bhq1;
[0122]
3c、4c、5c与2c相比,增加了序列中间的非配对区的碱基数。
[0123]
采用与实施例1相同的方法,验证mad7对不同reporter的切割效果。
[0124]
结果如图5所示,mad7对2c/3c/4c/5c的reporter均具有良好的切割效果,可以用于核酸检测;与此同时,采用cas12i进行检测,cas12i对上述reporter均不具有切割活性(如图5所示)。
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