一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞的制作方法

一种具有高敲除率的人pd1基因sgrna及含有该sgrna的质粒、t细胞
技术领域
1.本发明涉及一种具有高敲除率的人pd1基因sgrna及含有该sgrna的质粒、t细胞，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.pd
‑
1(程序性死亡受体1，programmed death 1) 蛋白属于免疫球蛋白超家族成员，可表达于活化的t细胞、b细胞和骨髓细胞，以及cd4
‑
cd8
‑
胸腺细胞。pd
‑
1有两个配体，即pd
‑
l1（b7
‑
h1）和pd
‑
l2（b7
‑
dc），均为b7家族中的新成员。pd
‑
1是免疫抑制性受体，与其配体pd
‑
l1、pd
‑
l2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。t细胞上的pd
‑
1与肿瘤细胞中的pd
‑
l1/ pd
‑
l2的结合，可抑制活化的t细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。
3.crispr/cas9技术是非常热门的基因编辑操作工具，目前华西医院已报道利用crispr技术敲除t细胞中的pd1，具有安全无副作用的优势。目前用于设计sgrna的网站有十多个，同一个基因设计出来的sgrna序列多达数百个，其每个sgrna导入细胞内后造成的敲除效率是不同的，需要筛选出敲除效率高的sgrna。
4.cn103820454b专利虽然提供了180个pd1的sgrna序列，但只给出了其中4个单sgrna和4个双sgrna的效果，对于其余sgrna并没有验证其敲除效率。cn107586777a专利虽然也提供了131个sgrna，但对于其效果只提供了sgrna活性，没有涉及具体的敲除效率。
5.cn105671083b专利仅公开了一个sgrna序列的效果，其余sgrna序列具有的敲除效率是未知的。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种具有高敲除率的人pd1基因sgrna及含有该sgrna的质粒、t细胞，实现以下发明目的：筛选出高敲除率的sgrna，提高t细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
7.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种具有高敲除率的人pd1基因sgrna，所述sgrna是敲除pd1基因的靶点；所述sgrna的核苷酸序列为序列表中seq id no：4、seq id no：6或seq id no：8所示。
8.以下是对上述技术方案的进一步改进：含有所述sgrna的质粒，将sgrna序列构建到px458载体中，得到含有sgrna的质粒。
9.含有所述sgrna的t细胞，将含有sgrna的质粒转染到t细胞中，得到含sgrna的crispr
‑
pd1
‑
t细胞。
10.所述crispr
‑
pd1
‑
t细胞的制备方法如下：步骤1、采集结肠癌患者外周血，分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗后，得到t细胞；收集的血浆经灭活、离心后，取上清，得到血浆上清。
11.步骤2、将t细胞加入kbm551培养基重悬细胞，使细胞密度保持在1
×
106个/ml，添加γ干扰素浓度为200 iu/ml，放入培养箱培养。
12.步骤3、γ干扰素作用24h后，添加cd3/cd28单抗和il
‑
2，浓度分别为50ng/ml和300 iu/ml，培养48h后得到活化的t细胞。
13.步骤4、在6孔板中加入2ml/孔新鲜的含有300 iu/ml il
‑
2的kbm551培养基，置于37℃培养箱中预热，得到预热的培养基；收集活化的t细胞，取1.5
×
107个细胞，用0.3ml电转液重悬，加入6μg含有sgrna的质粒混合均匀，选择电活化t细胞程序电转，电转完成后将细胞立即转移至预热的培养基中，放回37℃培养箱中继续培养。
14.步骤5、48h后，取细胞进行流式检测，检测电转的效率；取样计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和il
‑
2，使细胞的浓度维持在1
×
106个/ml，il
‑
2的浓度维持在300iu/ml，添加5vol%的血浆上清。
15.步骤6、48h后进行细胞计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和il
‑
2，使细胞的浓度维持在1
×
106个/ml，il
‑
2的浓度维持在300iu/ml，补加5vol%的血浆上清。
16.步骤7、48h后收集细胞，得到crispr
‑
pd1
‑
t细胞。
17.与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：本发明所述针对人pd1基因的sgrna靶点，转染到稳定表达pd1的293t细胞中，对pd1基因的敲除率为71.92
‑
90.97%；转染到t细胞中，对pd1基因的敲除率为58.26
‑
72.67%；本发明所述针对人pd1基因的sgrna靶点，转染到t细胞中，得到crispr
‑
pd1
‑
t细胞，对结肠癌细胞系lovo均表现出显著的特异性细胞毒性作用，效靶比为3:1时，crispr
‑
pd1
‑
t细胞对结肠癌lovo细胞系的杀伤效率为68
‑
83%；效靶比为10:1时，crispr
‑
pd1
‑
t细胞，对结肠癌lovo细胞系的杀伤效率为77
‑
95%；并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强；本发明所述针对人pd1基因的sgrna靶点，转染到t细胞中，得到crispr
‑
pd1
‑
t细胞对blab/c小鼠肿瘤生长具有抑制作用，从第一次免疫起10天内，65.3
‑
80%小鼠几乎触摸不到肿瘤；第一次免疫后10d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为59
‑
330 mm3，第一次免疫后12d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为29
‑
290 mm3，第一次免疫后15d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为7
‑
225mm3。
附图说明
18.图1为293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光和流式图；其中1a为293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图，1b为293t
‑
pd1稳转细胞系的流式图；图2为不同sgrna转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；其中2a为sg1转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；2b为sg2转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；2c为sg3转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；2d为sg4转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；2e为sg5转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；2f为sg6转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；
2g为sg7转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；2h为sg8转染293t
‑
pd1稳转细胞系的免疫荧光图；图3 为不同sgrna转染293t
‑
pd1稳转细胞系的t7en1酶切图；图4为本发明中crispr
‑
pd1
‑
t细胞对结肠癌细胞系lovo杀伤率图；图5为本发明中实施例7免疫后不同天数小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值的折线图。
具体实施方式
19.实施例1:针对人pd1基因crispr/cas9载体的构建1、筛选针对人pd1基因的有效sgrna靶点根据pd1的基因序列，设计针对pd1基因的有效的sgrna靶点。
20.表1列出了其中8条针对pd1基因的有效sgrna靶点序列。
21.表1 靶点pd1基因的sgrna靶点序列2、重组px458载体的构建本发明中选择的载体为px458载体（购自addgene），利用常规方法将表1中每个sgrna序列分别构建到px458载体中，其重组载体名称按顺序从上到下为px458
‑
pd1
‑
sg1、px458
‑
pd1
‑
sg2、px458
‑
pd1
‑
sg3、px458
‑
pd1
‑
sg4、px458
‑
pd1
‑
sg5、px458
‑
pd1
‑
sg6、px458
‑
pd1
‑
sg7、px458
‑
pd1
‑
sg8。
22.本发明中，8个重组质粒采用氯化铯法进行质粒提纯与浓缩，使其浓度达到1
µ
g/
µ
l。
23.实施例2：构建稳定表达pd1基因的293t细胞1、构建表达pd1蛋白的慢病毒本发明中选择的慢病毒载体为cd513b（购自addgene，pcdh
‑
cmv
‑
nluc
‑
ef1α
‑
coprfp
‑
t2a
‑
puro），将pd1基因编码区（genbank：ay238517.1）全长序列委托北京博迈德基因技术有限公司合成全长序列，利用xbai和ecori分别双酶切pd1基因和cd513b载体，回收酶切产物，利用t4 dna将两者连接起来，形成含有pd1基因的cd513b载体，命名为cd513b
‑
pd1，进行测序验证，正确后提取质粒，去除内毒素，本发明中提取的cd513b
‑
pd1质粒浓度为600ng/
µ
l。
24.2、利用293t细胞包装慢病毒复苏293t细胞，传代3次后用于转染；六孔板中按6
×
105个细胞/孔进行接种，加入2ml 含有10vol% fbs的dmem培养基（均购自gibco公司），为第二天的转染做准备。
25.转染前将六孔板中的培养基换成新的dmem培养基，37℃温箱中培养1h；重组慢病毒质粒cd513b
‑
pd1、与包装质粒pspax2与pmd2.g按4:2:3质量比例混合后，加入60
µ
l fugene hd（购自promega公司）转染试剂转染293t细胞，48小时后，显微镜下观察293t细胞转染后的形态变化和gfp的表达；72h后将含有病毒的细胞培养上清收集到离心管中，3500rpm/min离心10min，去除细胞碎片，4.5μm滤器过滤后以70000g，4℃离心2h，然后用100
µ
l的pbs重悬，得到病毒悬液，分装后放入
‑
80℃保存；病毒悬液中重组慢病毒cd513b
‑
pd1的病毒滴度为3.2
×
10
8 tu/ml。
26.3、慢病毒感染293t细胞，并用嘌呤霉素筛选稳定表达pd1的293t细胞六孔板内将复苏后293t细胞以6
×
105个/孔的密度铺板，加入2ml 含有10vol% fbs的dmem培养基孵育过夜，去除旧的培养基，加入moi=5的含重组慢病毒cd513b
‑
pd1的病毒悬液（步骤2制备的病毒悬液），并加入1.5ml的无血清dmem培养基；病毒转导后6h，再添加1ml含10vol% fbs的dmem培养基到细胞培养板内，然后孵育过夜；病毒转导后48h，更换2ml新鲜的筛选培养基，继续培养；每2天替换新鲜配制的筛选培养基，每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及gfp表达的水平及所占比例；当gfp表达比率达到95%以上时（见图1），筛选成功，命名为293t
‑
pd1，用pd1流式抗体来检测筛选后的293t细胞中pd1的表达率；本发明中，pd1的表达率为95.5%（见图1）。
27.上述筛选培养基为含有2
µ
g/ml的嘌呤霉素、10vol% fbs的dmem培养基。
28.实施例3：pd1 sgrna敲除效率的测定将293t
‑
pd1细胞以1
×
106个/孔的密度接种在六孔板内，孵育过夜。
29.将构建的8个不同的含pd1 sgrna的重组px458载体分别取4μg，与10
µ
l fugene hd转染试剂混合，加入dmem培养基至100
µ
l，静置15min形成复合物，将六孔板内的培养基吸掉，加入静置好的复合物，添加dmem培养基至2ml，放在37℃、5%co2的培养箱内培养6h，更换含有10vol%fbs的dmem培养基继续培养48h，荧光显微镜下观察转染情况（见图2），收集每组1孔细胞，利用flag流式抗体进行转染效率的测定；同时其余两孔细胞进行传代，传代后3天收集各组细胞，利用pd1流式抗体进行检测。
30.实验中设置两组对照组，对照组1是相同条件下培养的293t
‑
pd1，对照组2是以空载px458转染293t
‑
pd1；每组实验组设3个复孔，取其平均值。
31.本发明中，每组的转染率和pd1的表达效率如表2；根据敲除率公式，计算每组的敲除率；结果显示293t
‑
pd1
‑
px458
‑
sg4的敲除率最高，达到90.97%；293t
‑
pd1
‑
px458
‑
sg6的敲除率为71.92%；293t
‑
pd1
‑
px458
‑
sg8的敲除率为84.78%。
32.表2 实验组和对照组转染率、pd1表达率和敲除率
实施例4：利用t7en1酶切验证(1)将实施例3收集的各组细胞利用博迈德的磁珠法基因组提取试剂盒提取dna，用乙醇沉淀法纯化获得的pcr回收产物，利用表3中的引物扩增目的片段，其中sg5和sg7利用pd1
‑
f2/r2引物扩增，其余的用pd1
‑
f1/r1引物扩增。
33.(2)对于纯化的基因组dna 的pcr产物，配制以下反应体系：dna（100ng/
µ
l） 500ng；10
×
t7en buffer
ꢀꢀꢀꢀ2µ
l；无核酸酶ddh2o
ꢀꢀꢀ
加至19
µ
l；总体积
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
19
µ
l；将反应体系混合，高速离心数秒，在95℃加热5分钟；退火，将解链后的pcr产物冷却至室温。
34.（3）每反应体系加入1
µ
l浓度为2u/
µ
l的t7核酸内切酶i，在37℃反应40分钟。
35.（4）在每个酶切反应体系中加入 2 μl 的10
×ꢀ
loading buffer并混匀； 将一半的反应体系混合物加到含有2%琼脂糖胶的孔中，在tae或tbe缓冲液中进行电泳。
36.结果见图3，sg1到sg8均有两条目的条带，其中sg4目的条带最亮（跑胶图中下面两条带是目的条带），与其敲除率相对应。表4为pcr扩增长度和相对应的酶切片段长度。
37.表3 扩增目的片段的引物表4 t7en1酶切检测目的片段
实施例5 crispr
‑
pd1
‑
t细胞的制备本实施例中对293t
‑
pd1初筛得到的敲除率高的sg4、sg6、sg8进行验证，利用同一份外周血分离培养的免疫细胞进行电转，本次实验分为对照组和实验组，对照组有两组，一组为利用px458空载电转，一组为不进行电转的正常培养，实验组有三组，分别为px458
‑
pd1
‑
sg4、px458
‑
pd1
‑
sg6、px458
‑
pd1
‑
sg8。
38.1、采集结肠癌患者外周血，利用淋巴细胞分离液（购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司）分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗2遍，得到t细胞；收集的血浆56℃灭活30min后，3000rpm离心20min，取上清放置于4℃冰箱备用。
39.2、根据t细胞的计数结果加入kbm551培养基（购自corning）重悬细胞，使细胞密度保持在1
×
106个/ml，添加γ干扰素浓度为200 iu/ml，放入培养箱培养。
40.3、γ干扰素作用24h后，添加cd3/cd28单抗（购自北京同立海源生物科技有限公司）和il
‑
2（购自江苏金丝利药业股份有限公司），浓度分别为50ng/ml和300 iu/ml，培养48h后，得到活化的t细胞培养液。
41.4、电转前准备工作，在6孔板中加入2ml/孔新鲜的含有300 iu/ml il
‑
2的kbm551培养基，置于37℃培养箱中预热；将电转液（购自lonza的 p3 primary cell 4d x kit l 核转试剂盒，v4xp
‑
3024）从4℃冰箱中拿出，取1.5ml电转液置于离心管中恢复至室温，剩余的电转液放回4℃冰箱；收集活化的t细胞，取7.5
×
107个细胞，用1.5ml电转液重悬，平均分为五份，其中一份直接添加到预热的6孔板中，剩余4份分别加入6μg的px458、px458
‑
pd1
‑
sg4、px458
‑
pd1
‑
sg6、px458
‑
pd1
‑
sg8混合均匀，每个电转杯中加入的t细胞数量为5
×
106个，每份需要3个电转杯。
42.将电转杯放入lonza4d电转仪中，选择电活化t细胞程序电转，电转完成后将细胞立即转移至预热的培养基中，放回37℃培养箱中继续培养。
43.5、48h后，取细胞进行流式检测，检测电转的效率；取样计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和il
‑
2，使细胞的浓度维持在1
×
106个/ml，il
‑
2的浓度维持在300iu/ml，添加5vol%的血浆上清。
44.6、48h后进行细胞计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和il
‑
2，使细胞的浓度维持在1
×
106个/ml，il
‑
2的浓度维持在300iu/ml，补加5vol%的血浆上清。
45.7、48h后收集细胞，对细胞进行计数、活率检测、支原体检测，利用流式细胞仪对各组细胞进行pd1蛋白表达检测，计算实验组的敲除率。
46.本发明中，pd1蛋白的表达率如表5所示，其中px458
‑
pd1
‑
sg4
‑
t的敲除率最高，为72.67%，px458
‑
pd1
‑
sg6
‑
t和px458
‑
pd1
‑
sg8
‑
t的敲除率相近，分别为58.26%、60%。
47.表5 各组实验中pd1蛋白的表达率实施例6 crispr
‑
pd1
‑
t细胞对结肠癌lovo细胞系的杀伤活性研究体外毒性实验使用的材料如下：以结肠癌细胞系lovo作为靶细胞，效应细胞为如实施例5所制备的体外培养的crispr
‑
pd1
‑
t细胞，分别为px458
‑
pd1
‑
sg4
‑
t、px458
‑
pd1
‑
sg6
‑
t、px458
‑
pd1
‑
sg8
‑
t、px458
‑
t、t细胞。效靶比视情况分别为10:1、3:1、1:1和1:3，靶细胞数量为1
×
104个/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。检测时间为细胞混合后4 h。其中各实验组和各对照组如下：各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的t细胞，对照组1：靶细胞最大释放ldh，需加入一定体积的细胞裂解液 ；对照组2：靶细胞自发释放ldh；对照组3：效应细胞自发释放ldh；对照组4：空白培养基的背景；对照组5：体积校准的背景 ，空白培养基加入一定体积的细胞裂解液。
48.检测方法：采用cytotox96
®
非放射性细胞毒性检测试剂盒（promega公司）检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51cr释放法。cytotox检测定量地测量乳酸脱氢酶（ldh）。ldh是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的ldh培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中ldh可使一种四唑盐（int）转化为红色的甲臜（formazan），生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比（具体参照cytotox96
®
非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书）。
细胞毒性计算公式为：实验结果表明：具体如图4和表6所示，本发明筛选制备的三种crispr
‑
pd1
‑
t细胞对结肠癌细胞系lovo均表现出显著的特异性细胞毒性作用，其中px458
‑
pd1
‑
sg4
‑
t的细胞毒性作用要高于px458
‑
pd1
‑
sg6
‑
t和px458
‑
pd1
‑
sg8
‑
t的细胞毒性作用，效靶比为3:1时，对结肠癌lovo细胞系的杀伤效率为68
‑
83%；效靶比为10:1时，对结肠癌lovo细胞系的杀伤效率为77
‑
95%；并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强；其中px458
‑
pd1
‑
sg4
‑
t在效靶比10:1时对结肠癌细胞lovo的细胞毒性高达95％。效靶比依赖性的数据进一步显示本发明的crispr
‑
pd1
‑
t细胞对结肠癌细胞lovo的特异性细胞毒性作用。表6 crispr
‑
pd1
‑
t细胞对结肠癌lovo细胞系的杀伤效率实施例7：crispr
‑
pd1
‑
t细胞对blab/c小鼠肿瘤生长抑制作用18
‑
22g雄性blab/c小鼠(购自沈阳蓝谱达斯实验用品科技有限公司)于动物房饲养(室温23
±
2℃，湿度50%
±
10%)，收集对数期的结肠癌lovo细胞，磷酸盐缓冲液(pbs)稀释至2
×
105个/ml。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2ml结肠癌lovo细胞悬浮液，观察3
‑
5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
49.blab/c结肠癌模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90
‑
100mm3)随机分成6组，每组20只，开始注射治疗实验。
50.实验组分别为：a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；b.治疗一组，尾部静脉注射2
×
106个细胞/只正常t细胞；c.治疗二组，尾部静脉注射2
×
106个细胞/只px458空载电转的t细胞；d.治疗三组，尾部静脉注射2
×
106个细胞/只px458
‑
pd1
‑
sg4
‑
t细胞；e.治疗四组，尾部静脉注射2
×
106个细胞/只px458
‑
pd1
‑
sg6
‑
t细胞；f.治疗五组，尾部静脉注射2
×
106个细胞/只px458
‑
pd1
‑
sg8
‑
t细胞。
51.每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫两周，每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大小，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图5和表7所示。
52.表7免疫后不同天数小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值图5和表7结果显示，治疗三、四、五组可以明显减少肿瘤组织的大小，第一次免疫后10d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为59
‑
330 mm3，第一次免疫后12d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为29
‑
290 mm3，第一次免疫后15d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为7
‑
225mm3。