一种丁酸梭菌SLZX19-05及其应用

一种丁酸梭菌slzx19
‑
05及其应用
技术领域
1.本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌及其应用。


背景技术：

2.抗生素曾经对于人类和动物的健康发挥了至关重要的作用，挽救了无数人的生命。然而，近几十年的应用发现微生物可产生抗生素耐药性，长时间、大剂量的使用造成了耐药基因传播、环境污染和超级细菌的出现。并且，抗生素在畜牧业中的大量使用，对人类用于疾病治疗的抗生素的选择构成严峻挑战。与此同时，饲料中缺少了抗生素添加剂，却又对牧场动物消化道健康保障和集约化养殖效率构成严峻挑战。因此，寻找绿色安全、高效无毒的抗生素替代品对畜禽养殖具有重要意义。
3.目前，微生态添加剂应用于饲料行业中已有20多年的历史，在养殖业的疾病预防中表现出巨大的潜力，被认为是替代抗生素的重要候选产品。长期的研究证实，益生菌在促进动物生长、增强机体免疫力、消化道抗感染和调节肠道微生态平衡等方面发挥重要作用。
4.梭菌属是猪肠道菌群的核心属之一。丁酸梭菌(clostridium butyricum)，又称酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸菌。丁酸梭菌饲喂动物能够增加仔猪肠道菌群多样性，促进肠上皮细胞增殖，修复肠道黏膜损伤，减少肠道炎症和肿瘤的发生，还能够抑制大肠杆菌、柠檬酸杆菌等对肠道的感染，降低发病率和死亡率。
5.鼠柠檬酸杆菌(citrobacter rodentium)，属于肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。鼠柠檬酸杆菌，是条件致病菌，在肠道内菌群失调或免疫功能低下时，导致结肠增生和结肠炎，并易位引起内脏组织器官感染。因为均通过iii型分泌系统(t3ss)注入效应物引发感染，鼠柠檬酸杆菌常在小鼠进行试验，用于研究肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌感染的机制。
6.针对目前益生菌的应用情况，仍有必要不断开发新的菌剂来应对实际生产需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种抗生素敏感性强，耐酸、耐高温能力强，可维护动物肠道健康的丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05。
8.为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
9.本发明提供的丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05，该菌株于2021年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为丁酸梭菌clostridium butyricum，保藏编号为cgmcc no.22778。
10.丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05分离自西藏自治区山南市隆子县所属藏猪养殖合作社的藏猪粪便中。
11.丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05的微生物学特性如下：
12.(1)菌落形态：单菌落直径约1～2mm，颜色呈奶油色，不透明，菌落表面光滑微凸，
呈类圆形。
13.(2)染色后细菌形态：革兰氏阳性，梭杆状，有鞭毛，能运动。
14.(3)生长特性：在rcm液体培养基中，37℃培养，6h开始进入对数生长期，12h进入平台期，最大活菌数为1.6
×
107cfu/ml。
15.进一步地，本发明还提供丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05的发酵产物。含有丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05或发酵产物的菌剂。
16.本发明所述的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
17.本发明通过实验证明，丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05对酸和热有较高的耐受性，能够产生酸性磷酸酶、萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶，能够在动物体内定植，有良好的益生潜力，可以促进动物溶菌酶的产生，提高动物肠道抗细菌感染、抗病毒和抗寄生虫反应，改善动物肠道健康。
18.基于丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05，本发明还提供一种动物饲料添加剂或动物饲料，其含有丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05或上述发酵产物或菌剂，或由丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05制备得到。
19.本发明还提供一种药物，其含有丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05或上述发酵产物或菌剂，或由丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05制备得到。
20.以上所述的动物饲料添加剂、动物饲料或药物可由丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05制备得到，具体地，由丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05经发酵得到的菌体或发酵产物制备得到。
21.本发明另提供上述丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05或发酵产物或菌剂或动物饲料添加剂或动物饲料或药物在以下任一方面中的应用：
22.(1)产生丁酸，并分泌酸性磷酸酶和萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶；
23.(2)促进动物溶菌酶的产生；
24.(3)制备提高动物肠道抗细菌感染、抗病毒和抗寄生虫反应能力的产品；
25.(4)制备减少感染造成的腹泻和致病菌易位，改善动物肠道健康的产品。
26.本发明还提供所述丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05或发酵产物或菌剂在制备动物饲料添加剂、动物饲料或药物中的应用。
27.以上所述的应用中，所述动物饲料添加剂或所述药物具有如下特性中的至少一种：
28.(1)高效的产生丁酸，并分泌酸性磷酸酶和萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶；
29.(2)耐酸、耐热能力强；
30.(3)促进动物溶菌酶的产生；
31.(4)提高动物肠道抗细菌感染、抗病毒和抗寄生虫反应的能力；
32.(5)减少感染造成的腹泻和致病菌易位，改善动物肠道健康。
33.本发明通过实验证明，丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05可分泌酸性磷酸酶、萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶，酸性磷酸酶可促进消化道的先天性免疫和适应性免疫，促进机体防御功能。
34.本发明还提供所述丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05或所述菌剂在
制备丁酸中的应用。
35.本发明的有益效果在于：
36.本发明通过在藏猪粪便中分离获得一株丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05，其对酸和热有较高的耐受性，对抗生素敏感性强，能够高效产生丁酸，并产生酸性磷酸酶、萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶，能够在动物体内定植，有良好的益生潜力，可以促进动物肠道内溶菌酶的产生，提高动物肠道抗细菌感染、抗病毒和抗寄生虫反应，改善动物肠道健康。
37.本发明进一步验证了丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05对动物肠道健康的影响，以鼠柠檬酸杆菌dbs100作为致病菌建立损伤模型，发现该菌株能够增强小鼠肠道对鼠柠檬酸杆菌dbs100的预防作用，减少了有害菌的增殖和易位，保护机体健康。
附图说明
38.图1为本发明实施例1中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)的菌落形态图。
39.图2为本发明实施例1中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)的革兰氏染色后镜检图。
40.图3为本发明实施例2中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)的生长曲线。
41.图4为本发明实施例2中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)的活菌计数(bacterial amount)结果。
42.图5为本发明实施例2中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)的耐酸性检测结果。纵坐标代表存活率。
43.图6为本发明实施例2中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)的耐热性检测结果。纵坐标代表存活率。
44.图7为本发明实施例2中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)抗生素敏感性的结果。
45.图8为本发明实施例2中丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)api
‑
zym酶活检测结果。
46.图9为本发明实施例3中灌服丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)后的小鼠体重变化，纵坐标为每只小鼠的体重(g)。
47.图10和图11为本发明实施例3中灌服丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05(cgmcc no.22778)后的结肠转录组显著变化基因火山图。图中，纵坐标代表校正的差异性检验p值以10为底的负对数，横坐标代表基因表达差异倍数以2为底的对数，up代表显著上调的基因，down代表显著下调的基因，ns代表没有显著变化的基因。
48.图12和图13为本发明实施例3中不同试验组小鼠肠道转录组go分析图。其中，fold change指基因变化的倍数；category指富集到的上调的排名前5的基因条目及描述，分别为氨基聚糖的代谢过程(aminoglycan metabolic process)，抗原受体介导的信号通路(antigen receptor
‑
mediated signaling pathway)，b细胞受体信号通路(b cell receptor signaling pathway)，白细胞增殖(leukocyte proliferation)，淋巴细胞活化
的调控(regulation of lymphocyte activation)；细胞对干扰素β的反应(cellular response to interferon
‑
beta)，对病毒的防御反应(defense response to virus)，对干扰素β的反应(response to interferon
‑
beta),对寄生虫的反应(response to protozoan)，对病毒的反应(response to virus)；圆圈的size大小代表该基因条目下的差异基因的数目。
49.图14为本发明实施例3中不同试验组小鼠结肠he染色图。图中各标尺均代表200μm。
50.图15为本发明实施例4中不同试验组小鼠体重变化，纵坐标为每只小鼠的体重(g)，横坐标为天数。图中，*代表h_cb+c.rodentium组与c.rodentium组有显著差异，p<0.05。
51.图16为本发明实施例4中不同试验组小鼠粪便含水量的结果。纵坐标为粪便含水量。图中，**代表差异性检验p<0.01。
52.图17为本发明实施例4中不同试验组小鼠肝脏(liver)、脾脏(spleen)柠檬酸杆菌载菌量结果。图中，*代表差异性检验p<0.05，**代表差异性检验p<0.01。
53.各图中，con代表对照组，low dose代表低剂量丁酸梭菌组，high dose代表高剂量丁酸梭菌组。c.rodentium代表鼠柠檬酸杆菌感染组，h_cb+c.rodentium代表高剂量丁酸梭菌灌服后进行鼠柠檬酸杆菌感染组。
具体实施方式
54.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
55.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
56.实施例1丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05的分离与鉴定
57.一、菌株slzx19
‑
05分离
58.丁酸梭菌(clostridium butyricum)slzx 19
‑
05分离自西藏自治区山南市隆子县所属藏猪养殖合作社的藏猪粪便中，具体离方法如下：
59.1、初筛：取藏猪粪样1g，在无菌生理盐水中混匀，至于80℃的水浴锅中热处理10min，用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取不同稀释度的稀释液100μl在含有0.04g/l的rcm琼脂板上均匀涂布，37℃厌氧培养箱中培养24h，根据菌落形态和是否产酸在平板上随机选取有差异的单菌落，进行编号后接种到rcm琼脂板划线纯化培养。
60.2、复筛：将初步鉴定具有产酸能力的细菌，取1％体积的种子液(od＝0.8左右)接种于rcm培养基中，在37℃条件下进行厌氧发酵培养，对48h小时发酵液中短链脂肪酸的含量进行分析，成功发现一株slzx 19
‑
05具有较高的产生丁酸的能力。其短链脂肪酸(scfas)产生情况如表1所示。
61.表1 slzx 19
‑
05发酵液中scfas含量
[0062][0063]
二、菌株的形态学和16s rdna鉴定
[0064]
对上述分离得到的菌株slzx 19
‑
05进行形态学和16s rdna鉴定
[0065]
1、观察菌株在培养皿上的菌落形态，对形成菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态进行描述。筛选所得单菌落直径约1～2mm，颜色呈奶油色，不透明，菌落表面光滑微凸，边缘不规则，呈类圆形(图1)。
[0066]
2、对菌株slzx 19
‑
05进行革兰氏染色，采用光学显微镜观察菌体形态。菌株slzx 19
‑
05为革兰氏阳性，梭杆状，顶端圆钝，有芽孢(图2)。
[0067]
3、挑取菌株slzx 19
‑
05单菌落，使用细菌通用引物27f：agagtttgatcctggctcag(seq id no.1)；1492r：ggttaccttgttacgactt(seq id no.2)，进行菌落pcr扩增后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行16s rdna测序鉴定。在ncbi上将slzx 19
‑
05的16s rdna序列与数据库中所有已测定细菌的16s rdna序列进行比对，slzx 19
‑
05菌株与梭菌属的clostridium butyricum strain lq25的16s rdna序列的同源相似性最高，为100％，确定菌种类别为丁酸梭菌(clostridium butyricum)。
[0068]
上述试验结果表明，该菌为丁酸梭菌。该菌株slzx 19
‑
05已于2021年6年24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为丁酸梭菌clostridium butyricum，保藏编号为cgmcc no.22778。
[0069]
实施例2丁酸梭菌slzx 19
‑
05的特性检测
[0070]
种子液活化：将丁酸梭菌slzx 19
‑
05接种到灭菌的rcm液体培养基中，37℃厌氧静置16h后取出备用。
[0071]
1、生长曲线测定
[0072]
按1％接种量从种子液中吸取定量的丁酸梭菌菌液接种到rcm液体培养基中(od600＝0.176)，置入厌氧工作站中，37℃静置培养。每隔2h使用酶标仪测定发酵液在od600的值，并保存各时间段的发酵液，进行活菌计数。
[0073]
结果显示(图3和图4)，丁酸梭菌slzx 19
‑
05菌株在6h进入对数生长期，12h进入平台期，最大活菌数达到1.6
×
107cfu/ml(od600＝1.23)。
[0074]
2、耐酸性检测
[0075]
按1％接种量将丁酸梭菌slzx 19
‑
05的种子培养液分别接种到ph为1.0、2.0、3.0的生理盐水中，分别在0h、1h、2h、3h采用平板倾注法测定活菌数，计算细菌存活率。
[0076]
结果显示(图5)，ph 3的环境下1h对丁酸梭菌slzx 19
‑
05的存活率为97％，在ph 3的环境下3h，丁酸梭菌slzx 19
‑
05的存活率在12.5％以上；ph 2的环境丁酸梭菌slzx 19
‑
05的影响较大，1h后存活率在约为20％，2h后存活率为10％左右，而3h后仅存活0.75％；ph 1的环境下1h，丁酸梭菌slzx 19
‑
05存活率约为1.75％。以上结果表明，丁酸梭菌slzx 19
‑
05具有较强的耐酸性，能在ph 1的酸性环境中存活1小时以上。
[0077]
3、耐热性检测
[0078]
按1％接种量将丁酸梭菌slzx 19
‑
05的种子培养液分别接种到生理盐水中，将其分别置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，30min后采用平板倾注法测定活菌数，进行存活率计算。
[0079]
结果显示(图6)，30min后60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下，丁酸梭菌slzx 19
‑
05的存活率分别在100％、97.73％、6.15％、1％、1％左右。结果表明，丁酸梭菌slzx 19
‑
05具有较强的耐热能力。
[0080]
4、抗生素敏感性
[0081]
将丁酸梭菌slzx 19
‑
05在rcm琼脂板上均匀的涂布，将环丙沙星、红霉素、氯霉素、多西环素、复方新诺明、青霉素g、万古霉素、庆大霉素、头孢氨苄、多粘菌素的药敏片放置于琼脂板上。24小时后，取出观察细菌培养板记录生长情况。结果证明(图7)，丁酸梭菌slzx19
‑
05对环丙沙星、红霉素、氯霉素、多西环素、万古霉素、头孢氨苄比较敏感。
[0082]
5、api
‑
zym酶活检测
[0083]
将丁酸梭菌slzx 19
‑
05加入到api
‑
zym酶活检测试纸条的孔中，每孔65μl，37℃培养4h后，记录反应结果。结果如图8所示，丁酸梭菌slzx 19
‑
05能够表达酸性磷脂酶、萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶。
[0084]
实施例3丁酸梭菌slzx 19
‑
05对小鼠肠道功能的影响
[0085]
一、实验方法
[0086]
1、选取断奶一周后大约12g左右的c57bl/6j雄性小鼠，使用溶解有0.5g/l万古霉素，1g/l硫酸新霉素，1g/l甲硝唑，1g/l氨苄西林的饮水，构建伪无菌鼠模型，4周后选择18只伪无菌鼠，随机分为三组(con组为对照组，灌服无菌生理盐水；low dose组为低剂量丁酸梭菌组，灌服含2.1
×
105cfu/ml丁酸梭菌的生理盐水；high dose组为高剂量丁酸梭菌组，灌服丁酸梭菌浓度为2.1
×
106cfu/ml生理盐水)，每组6只小鼠。
[0087]
2、灌胃方式：每天灌胃1次，每次200μl，第3天粪便中检测到丁酸梭菌定植后停止灌胃，7天后采集食糜和组织样品。
[0088]
实验鼠房控制温度湿度恒定，光照时间为12小时，小鼠自由采食、饮水，每周清扫鼠笼一次。试验过程中，每天观察并记录小鼠的状态、存活情况，以及有无临床异常症状等。
[0089]
二、检测指标：
[0090]
1、试验期间，每天统计小鼠体重。
[0091]
2、收集小鼠结肠组织，装在1.5ml离心管中，放入液氮速冻后置于
‑
80℃冰箱保存。在提取总rna后，样品送至深圳微生态公司进行转录组分析。
[0092]
3.新鲜获取的组织置入多聚甲醛固定，用于组织he切片。
[0093]
三、试验结果
[0094]
1、生长性能：如图9所示，试验期间，各小组的小鼠体重没有出现显著差异。
[0095]
2、结肠转录组：从图10和图11可以看出，与对照组相比，low dose组和high dose组都出现了显著的lyz1溶菌酶基因表达水平的升高，分别升高11.5倍和14.3倍。而溶菌酶能够对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有不同程度的直接杀伤作用。通过go分析(图12和图13)，本发明发现丁酸梭菌组与对照组相比，category所列生理过程显著增强(相关生
理过程的多个基因表达量上调)。尤其，显著增强了白细胞增殖(leukocyte proliferation)和淋巴细胞活化的调控(regulation of lymphocyte activation)过程，同时对病毒(response to virus)和对寄生虫反应(response to protozoan)的反应明显增强。这个结果初步说明，灌服高剂量丁酸梭菌能有效促进结肠组织的抗感染作用，保证肠道健康。
[0096]
3、he切片：从图14组织切片看，结肠组织均发育正常，无论low dose组和high dose组隐窝杯状细胞更多，体积更大。这个结果说明，丁酸梭菌的定植改善了结肠组织结构发育。
[0097]
实施例4丁酸梭菌slzx 19
‑
05对柠檬酸杆菌dbs100(atcc,51459)感染小鼠肠道的防御功能
[0098]
一、实验方法
[0099]
同实施例3所描述，构建伪无菌鼠，选择18只小鼠，进行随机分为三组(con组为对照组，灌服无菌生理盐水；c.rodentium组先灌服无菌生理盐水，后灌服柠檬酸杆菌dbs100感染小鼠；h_cb+c.rodentium组小鼠先灌服含2.1
×
106cfu/ml丁酸梭菌，后灌服柠檬酸杆菌dbs100感染小鼠)，每组6只小鼠。前3天灌服200μl的生理盐水或者丁酸梭菌溶液后，第7天灌服200μl浓度为1
×
109cfu/ml的柠檬酸杆菌dbs100以感染小鼠。一周以后采样。
[0100]
二、检测指标：
[0101]
1、感染期间，每天统计小鼠体重。
[0102]
2、统计小鼠感染性腹泻的情况。
[0103]
3、统计小鼠肝脏、脾脏指数和柠檬酸杆菌载菌量。
[0104]
三、试验结果
[0105]
1、体重：如图15和表2所示，试验期间c.rodentium组小鼠平均体重有所下降，但相较于对照组没有出现统计学差异。但相对于c.rodentium组，h_cb+c.rodentium组小鼠体重有显著的升高。
[0106]
表2感染期间小鼠的平均体重
±
标准误
[0107]
[0108]
2、腹泻：如图16和表3所示，柠檬酸杆菌dbs100感染导致c.rodentium组小鼠的粪便含水量显著升高，提示有腹泻的症状。但是，预先灌服丁酸梭菌的小鼠粪便平均含水量显著低于c.rodentium组小鼠，证明腹泻程度低。
[0109]
表3试验结束时小鼠的平均粪便含水量
±
标准误
[0110][0111]
3、内脏器官载菌量：如图17和表4所示，柠檬酸杆菌dbs100感染导致小鼠肝脏和脾脏的柠檬酸杆菌的平均载菌量显著升高。而预先灌服丁酸梭菌的小鼠肝脏和脾脏中柠檬酸杆菌的载菌量显著低于c.rodentium组。这个结果说明，丁酸梭菌增强了小鼠肠道屏障和抗柠檬酸杆菌感染的能力，减少了致病菌的易位。
[0112]
表4小鼠的肝脏和脾脏中柠檬酸杆菌的平均载菌量
±
标准误
[0113][0114]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。