一种红白锦鲤性别特异DNA标记及其应用

一种红白锦鲤性别特异dna标记及其应用
技术领域
1.本发明属于水产遗传育种中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及红白锦鲤性别特异dna标记及遗传性别鉴定方法。


背景技术：

2.锦鲤(cyprinus carpio haematopterus)隶属于鲤形目、鲤科、鲤属。锦鲤体格健美、色彩艳丽、花纹多变、泳姿雄然，具极高的观赏和饲养价值，有“水中活宝石”、“会游泳的艺术品”的美称。红白锦鲤是白底上有红色花纹的锦鲤品种，是“御三家”之一，在日本被认为是锦鲤的正宗。
3.锦鲤其性别决定机制为(xx/xy)型，遗传雌性为同型性染色体(xx)，遗传雄性为异型染色体(xy)。自然条件下，雌性锦鲤产生x型卵子，雄性锦鲤产生x、y型两种精子，受精后得到正常的xx雌性和xy雄性后代。在人工繁育及选择育种过程中，为了获得优质的苗种必须做好亲鱼的雌雄筛选，为了建立家系，必须能准确鉴定锦鲤的性别。锦鲤第一次性成熟需要2
‑
3年，在稚鱼和幼鱼时期很难通过外观形态鉴定锦鲤的性别，限制了锦鲤人工繁育和良种选育的研究进程。因此，开发锦鲤性别特异分子标记，建立快速鉴定锦鲤遗传性别的分子方法是控制雌雄亲本性别比例、鉴定性染色体、研究性别决定和性染色体进化机制的重要手段。
4.有关锦鲤性别特异分子标记的筛选和遗传性别鉴定研究，目前国内外尚未见报道。因此，发掘锦鲤性别特异分子标记，建立一种能采用琼脂糖凝胶电泳方法准确分辨、且可以在养殖场现场应用的锦鲤遗传性别快速鉴定的分子技术成为锦鲤养殖产业中亟待攻克的重要课题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种红白锦鲤性别特异dna标记及其应用，所述的dna标记是通过红白锦鲤雌、雄鱼微卫星引物筛选，发现了红白锦鲤性别特异的dna标记；并将该dna标记应用到锦鲤遗传性别鉴定。
6.本发明首先提供一种红白锦鲤雌、雄鱼的性别特异dna标记，所述的dna标记的信息如下：
7.雄鱼的dna标记片段，其序列如下：
8.caggtatgaggcgtgtttcacattcagttgaaaaattctactaattcctcagaaatcacaatcctaaatgactggtgtgtgtgtgtgtgcgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgtgcgtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcgtgtgtgtgttcagctcctgatgtgtctgtggtgagcagcagtgtatctggacatgaaggtggtga(seq id no:1)；
9.雌鱼的dna标记片段，其序列如下：
10.caggtatgaggcgtgtttcacattcatttgaaaaattctacttattcctcagaaatcacaatcctaaatgactggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttcagctcctgatgtgtctgtggtgagcagcagtgta
tctggacatgaaggtggtga(seq id no:2)；
11.本发明还提供一种鉴定红白锦鲤遗传性别的方法，是通过检测红白锦鲤雌、雄鱼的性别特异dna标记存在与否来确定待检测的红白锦鲤的性别；
12.所述的检测，其一种方法是进行pcr扩增，扩增产物进行测序确定性别；
13.所述的检测，其一种方法，是对扩增产物进行凝胶电泳，通过扩增片段大小来鉴定性别；
14.其中pcr扩增的引物，其一种具体的序列信息如下：
15.f:5
′‑
caggtatgaggcgtgtttca
‑3′
(seq id no:3)、
16.r:5
′‑
tcaccaccttcatgtccaga
‑3′
(seq id no:4)、
17.上述的引物对，在红白锦鲤的遗传雌性(xx)个体中扩增出164bp的dna片段；在遗传雄性个体(xy)中扩增出234bp的dna片段。
18.本发明再一个方面还提供一种用于鉴别红白锦鲤性别的检测试剂制品，所述的制品中包含有用于实施上述方法的制剂。
19.本发明获得了红白锦鲤遗传性别特异的dna标记，并建立了鉴定红白锦鲤遗传性别的方法，采用本发明的方法可以快速、准确、有效的区分红白锦鲤遗传性别。本发明方法所使用的引物对在红白锦鲤雄性个体中扩增出234bp的dna条带，而在雌性个体扩增出164bp的dna条带。并可以用琼脂糖电泳分辨，缩短了准确鉴定红白锦鲤遗传性别的时间，适用于养殖场简易环境内锦鲤遗传性别的鉴定，节约了检测时间和成本。本发明检测红白锦鲤遗传性别的方法，对红白锦鲤亲鱼繁育、家系建立及控制养殖群体的雌雄性别比例，推动红白锦鲤养殖业可持续健康发展具有重要意义和应用价值。
附图说明
20.图1：本发明的红白锦鲤遗传性别特异dna片段序列比对图，引物位置用下划线表示；
‑
表示雌雄dna片段差异序列缺失序列；
21.图2：遗传雌雄红白锦鲤pcr产物2％琼脂糖凝胶电泳结果图，
♀
：生理雌鱼；
♂
：生理雄鱼；m：dl 2000dna maker；图中红白锦鲤出现单条带的为遗传雌鱼，红白锦鲤出现234bp和164bp的双条带为遗传雄鱼。
具体实施方式
22.本发明通过对红白锦鲤雌、雄鱼微卫星引物筛选，随后经过测序、生物信息学方法比对，发现了红白锦鲤雌、雄的特异性dna标记，其中雄鱼上dna片段长度比雌鱼上dna的对应片段多了70个bp；多出来的片段即为雄性特有的dna片段，其存在与否可用来鉴别红白锦鲤雄遗传性别。
23.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
24.实施例1红白锦鲤性别特异分子标记的筛选与验证
25.通过来源于普通鲤鱼中的微卫星位点设计同源引物，筛选获得了雌雄红白锦鲤的差异dna标记，其中雄鱼上出现234bp的dna片段：
26.caggtatgaggcgtgtttcacattcagttgaaaaattctactaattcctcagaaatcacaatcctaaatgactggtgtgtgtgtgtgtgcgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgtgcgtgcgtgcgtgtgt
gtgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcgtgtgtgtgttcagctcctgatgtgtctgtggtgagcagcagtgtatctggacatgaaggtggtga
27.雌鱼上出现164bp的dna片段：
28.caggtatgaggcgtgtttcacattcatttgaaaaattctacttattcctcagaaatcacaatcctaaatgactggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttcagctcctgatgtgtctgtggtgagcagcagtgtatctggacatgaaggtggtga
29.其中雄鱼dna片段比雌鱼上的片段多出70bp(图1)，这个多出来的片段可用来鉴别红白锦鲤雄遗传性别。
30.设计了扩增上述差异片段的引物对，其序列信息如下：
31.f:5
′‑
caggtatgaggcgtgtttca
‑3′
(seq id no:3)、
32.r:5
′‑
tcaccaccttcatgtccaga
‑3′
(seq id no:4)。
33.选择已知生理性别的雌、雄锦鲤dna，分别使用上述的引物对进行pcr扩增，反应条件及程序如下：pcr反应体系共25μl，包括9.5μl ddh2o；12.5μl pcr mix；1.0μl上游引物(10μmol/l)；1.0μl下游引物(10μmol/l)；1.0μl模板dna，混匀后离心。pcr扩增程序：95℃ 3min；95℃ 10s、60℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min，4℃保存。
34.pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳可看出雌、雄个体存在差异。将雌、雄差异片段回收连接pmd19
‑
t载体，转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛华大基因测序。测序结果验证了x、y染色体上的同源差异dna片段的序列。电泳结果表明雄性个体中均能扩增出234bp的dna条带，而在雌性个体扩增出164bp的dna条带(图2)。
35.实施例2：红白锦鲤遗传性别鉴定技术的建立与应用
36.1.实验室条件下锦鲤遗传性别鉴定
37.dna提取：使用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(tianamp genomic dna kit，北京，天根生化科技有限公司)提取已知性别红白锦鲤血液dna，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用超微量分光光度计测量其od值，调整dna浓度至50ng/μl，于
‑
20℃冻存待用。
38.pcr鉴定：使用红白锦鲤性别特异的dna片段引物对(seq id no:3；seq id no:4)，通过pcr方法检测红白锦鲤遗传性别。pcr反应体系25μl，其中9.5μl ddh2o；12.5μl pcr mix；1.0μl上游引物(10μmol/l)；1.0μl下游引物(10μmol/l)；1.0μl模板dna，混匀后离心。pcr扩增程序：95℃ 3min；95℃ 10s、60℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min，4℃保存。加入10
×
loading buffer 2.0μl，2％琼脂糖凝胶电泳，150v，20分钟，凝胶成像可分辨遗传性别。
39.将基因分型结果与对应样品记录性别进行比对，表明雄性个体中均能扩增出234bp的dna条带，而在雌性个体扩增出164bp的dna条带。说明通过此引物能够准确鉴别红白锦鲤的遗传性别。
40.2.养殖场条件下锦鲤遗传性别鉴定
41.材料获得：在济南市历城区某锦鲤养殖场取样品，可采用剪鳍条、抽血两种方式。抽血：可用采血针尾静脉抽取1ml新鲜血液，加入200ul抗凝剂备用。鳍条：可用消毒解剖剪剪取红白锦鲤背鳍或尾鳍的少量鳍条，打碎处理为细胞悬液，然后10000rpm离心1min，除去上清备用。同时进行性腺采集，
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80℃保存备用。
42.dna提取：使用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(tianamp genomic dna kit，北京，天根生化科技有限公司)提取红白锦鲤血液dna，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用超微量分光光度计测量其od值，调整dna浓度至50ng/μl，于
‑
20℃冻存待用。
43.pcr鉴定：使用红白锦鲤性别特异的dna片段引物对(seq id no:3；seq id no:4)，通过pcr方法检测红白锦鲤遗传性别。pcr反应体系25μl，其中9.5μl ddh2o；12.5μl pcr mix；1.0μl上游引物(10μmol/l)；1.0μl下游引物(10μmol/l)；1.0μl模板dna，混匀后离心。pcr扩增程序：95℃ 3min；95℃ 10s、60℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min，4℃保存。加入10
×
loading buffer 2.0μl，2％琼脂糖凝胶电泳，150v，20分钟，凝胶成像可分辨遗传性别。对性腺进行组织切片验证，结果表明基因分型结果与对应样品性腺的检测结果一致。