马铃薯stabl1基因在调控马铃薯熟性中的应用
技术领域：
：1.本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及的是马铃薯stabl1基因在调控马铃薯熟性中的应用。
背景技术：
：：2.马铃薯(solanumtuberosuml.)是仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物，对粮食安全起着至关重要的作用。它的主要食用部位为地下储藏器官或称为块茎，这些块茎积累了大量的淀粉和维生素c。马铃薯生产实践中，熟性和块茎淀粉含量是育种时重要的两个农艺性状。淀粉的含量影响马铃薯鲜食口感和加工品质，占块茎干物质的80％左右。而熟性不同的品种可以根据不同地区和气候的变化，满足市场的需求。马铃薯块茎被用作研究特殊营养器官形成的模型，其特征是在不同的光周期或不利条件下采用有性繁殖和营养繁殖来生存的双重繁殖系统(khosaetal.,2021；ziereretal.,2021)。贮藏器官形成和开花诱导受到分子级联途径调节，其中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(pebp)基因家族的成员floweringlocust(ft)是主要参与者(navarroetal.,2011；navarroetal.,2015)。马铃薯的长日照(ld)开花和短日照(sd)结薯由两种不同的ft同源基因调控，分别称为开花素stsp3d和结薯素stsp6a(navarroetal.,2011)。3.马铃薯熟性受到主效数量性状位点(qtl)的调控。在马铃薯中，stsp6a的诱导表达与植株衰老进程同步(lehretzetal.,2019)。块茎形成起始、开花、叶片衰老和生命周期长度被认为是植物成熟的几个重要熟性性状，并作为马铃薯成熟的评估标准(viskeretal.,2003)。然而，这些几乎同时发生的发育变化之间生物学关系仍然未知。前人研究发现超量表达参与马铃薯光周期诱导的基因stcdf1.2，植株表现出加速衰老的迹象，并比对照提前5周结束生命周期(kloostermanetal.,2013)，但其他相关报道几乎没有。4.尽管ft基因及其蛋白复合体在马铃薯开花和块茎形成中的功能被发掘的越来越多，但ft基因在同步马铃薯成熟亚性(包括块茎形成、开花、叶片衰老和植物生命周期的长短)中的分子作用模式目前还不得而知。因此，马铃薯stsp6a在整个植物生命周期中发挥重要作用，研究stsp6a相关调节机制有重要的理论和现实意义。5.根据拟南芥相关报道以及马铃薯生物信息分析，筛出了可能与马铃薯早熟相关的stabl1基因。目前，关于stabl1基因在马铃薯块茎发育过程中的功能并无相关文献报道。技术实现要素：6.鉴于现有技术的不足，本发明提供了马铃薯stabl1基因在调控马铃薯熟性中的应用，通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以栽培种鄂马铃薯3号叶片的cdna为模板，克隆了stabl1基因，并构建超量表达载体，遗传转化鄂马铃薯3号和e109进行转基因功能验证，发现超量表达stabl1基因能够促进马铃薯早熟，主要表现在叶片提前衰老、提前开花、地下部提前结薯以及生命周期缩短等特征。7.为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：8.1.stabl1基因，鄂马铃薯3号stabl1基因cds序列如序列表seqidno：1所示。马铃薯基因组数据库(http://spuddb.uga.edu/)公布的序列id为soltu.dm.10g025990.1。上述两者序列完全一致。9.2.stabl1基因克隆和功能验证方法，包括如下步骤：(1)引物设计；(2)rna提取；(3)cdna制备；(4)pcr反应和表达载体构建。10.3.马铃薯stabl1基因在促进地上部分提前开花过程中的应用。11.4.马铃薯stabl1基因在促进地下部分提前结薯中的应用。12.5.马铃薯stabl1基因在促进植株生命周期缩短过程中的应用。13.6.马铃薯stabl1基因在促进马铃薯早熟的应用。14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：15.(1)转基因株系及对照e3体内和体外的结薯实验中，超量表达stabl1基因结薯时间比e3提前，表明超量表达stabl1基因能明显促进块茎形成。16.(2)转基因超量株系及对照e109在长日照生长室40天左右，发现超量株系oe‑stabl1(1、2)已经开花，而对照未开花，表明超量表达stabl1基因能明显促进地上部分开花。17.(3)转基因超量株系及对照e3在长日照网室90天左右，超量株系oe‑stabl1(10、13)地上部分几乎完全枯死，e3仍保持正常的生命活力，表明超量表达stabl1基因能明显缩短植株生命周期。18.(4)转基因超量株系及对照e3取单节段在黑暗和光照条件下培养5天，oe‑stabl1(10、13)株系在暗培养条件下明显黄化，e3仍保持较绿的状态，表明stabl1基因响应衰老信号。附图说明19.图1：酵母双杂实验互作验证中，stabl1基因c端与完整的stsp6a基因在酵母中互作，将stsp6a基因上与st14a结合位点突变掉两个氨基酸后，蛋白互作变得很弱。20.图2：超量株系oe‑stabl1(10、13)和鄂马铃薯3号在体外培养4周和9周后结薯情况。图a分别为培养4周和9周后试管薯结薯情况，比例尺：5厘米；图b为体外培养第4周到第8周结薯植株占总数的百分比统计。21.图3：超量株系oe‑stabl1(10、13)和鄂马铃薯3号种植在长日照生长室4周，转入短日照5天后地下结薯情况。图a为短日照培养5天后地下块茎形成情况，比例尺：5厘米；图b为分别在转入短日照5天和10天后每株结薯数统计。22.图4：超量株系oe‑stabl1(10、13)和鄂马铃薯3号在长日照网室生长90天。图a为地上部分表型，比例尺：25厘米；图b为60天后每隔5天统计地上部分存活率情况。23.图5：超量株系oe‑stabl1(1、2)和e109在长日照生长室种植40天。图a为地上部分开花表型，比例尺：10厘米；图b为超量株系oe‑stabl1(1、2)和e109有花蕾的百分比，n＝8。图c为超量株系oe‑stabl1(1、2)和e109中植物开花的百分比，dap，种植后的几天，n＝8。24.图6：超量株系oe‑stabl1(10、13)和鄂马铃薯3号在长日照生长室生长45天后地上部分表型。25.图7：分别在暗处理和光照下培养5天后超量株系oe‑stabl1(10、13)和鄂马铃薯3号植物叶片的表型。光照条件下茎段均生长正常，暗处理条件下oe‑stabl1(10、13)株系叶片明显黄化，e3叶片大部分仍保持绿色。具体实施方式26.为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其它细节。27.实施例128.该实施例提供获得与马铃薯块茎发育相关的转录因子stabl1基因的方法。29.马铃薯中a类bzip家族成员存在功能冗余，且有能与stsp6a互作的sapmotif(teoetal.,2017)，根据蛋白互作筛选(见图1)，我们发现areb/abf/abi5亚家族的成员stabi5like1能与stsp6a互作，且在各发育器官中表达量较高因此，猜测该基因可能也参与马铃薯生长发育，我们将该基因命名为stabl1。30.实施例231.该实施例提供马铃薯stabl1基因、克隆方法和功能验证方法，具体包括如下步骤：32.(1)引物设计33.本发明中的stabl1基因根据马铃薯基因组数据库(http://spuddb.uga.edu/)公布的序列(soltu.dm.10g025990.1)(如序列表seqno.2)设计引物扩增该基因的cds全长序列，引物序列如下：34.stabl1f(5’‑atgggatctcagggtggtg‑3’)35.stabl1r(5’‑ttagacgggcgcggagcttgttctg‑3’)36.另外设计了stabl1的定量引物，引物序列如下：37.qstabl1f(5’‑gaactggagaacaaggtttcac‑3’)38.qstabl1r(5’‑gacataacgaacactacgcatc‑3’)39.(2)rna提取40.取栽培种鄂马铃薯3号(e3)的叶片样品，在液氮中磨成粉末，按照庄盟生物公司的planttotalrnakit通用植物组织总rna快速提取试剂盒进行rna抽提。具体方法如下：41.①取60‑100mg上述样品粉末于1.5ml的离心管中，加入1ml裂解液rl，立即震荡20秒使其混匀充分裂解，在15‑30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全裂解。42.②每1mlrl加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。43.③于4℃12000rpm，高速离心10分钟，用移液器将上层水相转移到新的1.5mlrnasefree的离心管中。44.④加入水相体积一半也就是0.5倍的无水乙醇充分混匀，将得到的溶液和可能沉淀一起转入收集管的吸附柱ra中。12000rpm离心1分钟，弃去废液，将吸附柱重新套回收集管。45.⑤加入500μl漂洗液rw，12000rpm离心1分钟，弃掉废液。46.⑥加入500μl漂洗液rw，12000rpm离心1分钟，弃掉废液。47.⑦将吸附柱ra放回空的收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。48.⑧将吸附柱放入新的1.5mlrnasefree的离心管中，在吸附膜的中间部位加50‑80ulrnasefreewater，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。49.⑨将所得的rna溶液取4μl进行琼脂糖凝胶(1％琼脂糖胶)电泳，检测rna质量和浓度，质量合格的用于后续反转录cdna制备实验。50.(3)cdna制备51.将上述提取的rna在rnase‑free的200μl八连排离心管中配置如表1所示的反转录体系，根据提取的rna浓度，以最低浓度加12μlrna为标准，其他rna加相应体积的水，将所有rna浓度调为一致，再加1μloligodt18(50μm)，混匀后65℃加热5min，迅速置于冰水浴骤冷，并在冰上静置2min。52.表1rna模板变性体系53.table1reactionmixtureofrnatemplatedenaturation[0054][0055][0056]将上述反应产物配置如表2所示的反应体系，按照如下程序合成cdna第一链。反应程序：1：25℃5min；2：50℃45min；3：85℃5min。产物可立即用于pcr反应，或在‑20℃保存。[0057]表2第一链cdna合成反应体系[0058]table2reactionmixtureofsynthesizingthefirststrandcdna[0059][0060](4)pcr反应和表达载体构建[0061]以上述得到的cdna为模板，使用已合成好的扩增引物序列，配制如表3所示的pcr反应体系(试剂来自诺唯赞公司)，克隆stabl1的cds序列(1044bp)。反应程序为：1:95℃，3min；2:95℃，30s；3：55℃，30s；4:72℃，90s；5:2‑4步35个循环；6:72℃5min；10℃保存。[0062]表3phanta高保真酶的pcr反应体系[0063]table3reactionmixtureofpcrwith2×phantaturbomastermix[0064][0065]pcr扩增得到的产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后切胶回收目的片段。琼脂糖胶回收使用的是小量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(zp202‑3，庄盟)，操作步骤严格按照说明书进行，最后用30μl无菌ddh2o洗脱。取3μl产物进行用1％琼脂糖胶电泳检测，对产物质量和浓度进行检测。[0066]质粒载体酶切，根据插入片段的不同选择相应限制性内切酶(takara)和酶切体系。对于载体线性化，以pbi121质粒为例，酶切体系如表4所示，反应条件为37℃，酶切3‑5h，反应结束后置于65℃，15min，使内切酶失去活性。[0067]表4酶切反应体系[0068]table4reactionmixtureofdigestion[0069][0070]将胶回收的目标片段连接至pbi121载体上，然后转化至大肠杆菌dh5α。长出菌落后，挑取单克隆用400μl对应抗性的lb在37℃200rpm培养4‑5h，用相应引物pcr检测，检测为阳性后测序，选取无突变的克隆，摇菌，提取质粒，细菌质粒提取采用的是质粒小量提取试剂盒(zp101，庄盟)，操作步骤严格按照说明书进行。同时用无菌的50％甘油保存，700μl菌液加300μl甘油，用液氮迅速冷冻后保存于‑80℃低温冰箱中。测序正确的目标载体命名为35s:gfp‑stabl1。[0071]超量表达stabl1基因促进马铃薯早熟广泛性的验证，具体验证步骤如下：[0072](1)植物表达载体构建[0073]按照上述载体构建方法，构建了35s:gfp‑stabl1，将质粒电击转化至农杆菌gv3101中。具体操作如下：[0074]①提前用纯无水乙醇清洗电转杯，杀死上次使用残存的菌，倒放于吸水纸上，一起放入超净工作台，同时放入电转仪，调至“bacteria”档，检查电转仪是否正常工作，再放入无菌枪头及合适量程的枪，紫外灯灭菌约10min；[0075]②期间在冰上放置需转化的质粒以及待活化的gv3101农杆菌，10min后，将电转杯放于冰上预冷，以免直接热激农杆菌；[0076]③取2μl质粒于农杆菌中，反复吸打混匀进行电转，用400μlyeb将菌液洗出至原农杆菌离心管，28℃250rpm复苏2h及以上；[0077]④4000rpm离心4分钟，根据实验要求，吸取不同体积已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的yeb琼脂培养基上将细胞均匀涂开。待液体被吸收后封口，倒置平板，28℃培养2‑3天。[0078]⑤挑取单菌落进行pcr菌落检测，获得阳性克隆。[0079](2)马铃薯遗传转化[0080]将上述超量表达的农杆菌gv3101划线于yeb固体培养基上进行活化，挑取单克隆于20mlyeb液体培养基中，28℃200rpm培养24小时；取2ml菌液于40mlyeb液体培养基中，28℃200rpm进行亚培养，直至od600约为0.5(约6小时)；5000rpm，离心6分钟，去上清，加10ml3％ms液体培养基重悬。[0081]35s:gfp‑stabl1菌液侵染e3过程如下：将生长6‑8周的e3试管薯横切为厚度约1‑2mm的薄片；然后在上述重悬液中侵染10分钟，中途轻轻地摇一下；弃菌液，用无菌滤纸吸干表面菌液，然后转入p1共培养培养基(3％ms固体培养基+0.2mg/lga3+0.2mg/liaa+0.5mg/l6‑ba+2mg/lzt，ph5.8)，23℃培养箱黑暗培养48小时。再转至p2分化培养基(3％ms固体培养基+0.2mg/liaa+0.2mg/lga3+2mg/lzt+0.5mg/l6‑ba+75mg/lkan+400mg/lcef)，23℃培养箱培养(16小时光照/8小时暗光周期)。当抗性芽生长至0.5‑1cm时将其接种至p3生根培养基(3％ms+50mg/lkan+400mg/lcef)，抗性芽长大后进行二次生根，随后进行阳性检测。[0082]35s:gfp‑stabl1菌液侵染e109过程如下：将生长6‑8周的e109试管薯横切为厚度约1‑2mm的薄片；然后在上述重悬液中侵染10分钟，中途轻轻地摇一下；弃菌液，用无菌滤纸吸干表面菌液，然后转入p1共培养培养基(3％ms固体培养基+0.2mg/lga3+0.15mg/liaa+0.3mg/l6‑ba，ph5.8)，23℃培养箱黑暗培养48小时。再转至p2分化培养基(3％ms固体培养基+0.15mg/liaa+0.2mg/lga3+2mg/lzt+0.3mg/l6‑ba+75mg/lkan+200mg/lcef+200mg/ltim)，23℃培养箱培养(16小时光照/8小时暗光周期)。当抗性芽生长至0.5‑1cm时将其接种至p3生根培养基(3％ms+50mg/lkan+400mg/lcef)，抗性芽长大后进行二次生根，随后进行阳性检测。[0083]实施例3[0084]该实施例提供马铃薯stabl1基因的应用，具体如下：[0085]以e3为遗传材料，转化的超量株系为oe‑stabl1(10、13)；以e109为遗传材料，转化的超量株系为oe‑stabl1(1、2)。在体外结薯实验中，我们将单节段的超量株系oe‑stabl1(10、13)和e3转入含8％蔗糖的ms固体培养基中，辅以0.2％的活性炭，放在短日照生长室培养。从第四周开始每周记录结薯情况。在体内结薯实验中，将超量株系oe‑stabl1(10、13)、对照e3、超量株系oe‑stabl1(1、2)和对照e109种于网室，长日照培养4周左右(10叶期)，将超量株系oe‑stabl1(10、13)和对照e3转入短日照，每5天观察一次表型，超量株系oe‑tuberigencomplex.plantcellphysiol.58:365‑374.当前第1页12当前第1页12