一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素D产量的方法与流程

一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d产量的方法
技术领域
1.本发明涉及分段发酵技术领域，具体涉及一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d产量的方法。


背景技术：

2.杆菌霉素d是一种能强烈抑制病原真菌的脂肽化合物，在控制农业病原真菌污染、保障粮食安全具有潜在的应用价值。我国每年会产生大量的玉米秸秆，玉米秸秆含有大量纤维素和半纤维素等大分子碳水化合物。将玉米秸秆应用于微生物发酵，生产一些有价值的目标代谢产物，已经成为国内外研究者热点。由于微生物在自然条件下合成杆菌霉素d的能力较弱，这限制了杆菌霉素d的大规模工业化应用。因而采用高效发酵策略，提高杆菌霉素d 合成能力显得十分必要。目前虽然已有杆菌霉素d的微生物发酵生产方法，但产量仍较低。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d产量的方法。本发明所述方法能够降低生产成本，有效提高杆菌霉素d的产量。
4.本发明提供了一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d 产量的方法，包括以下步骤：
5.将枯草芽孢杆菌种子液接种于含玉米秸秆酶解液上清液的发酵培养基上，进行分段发酵，取发酵液进行离心、酸沉、旋蒸、干燥，得到杆菌霉素 d；
6.所述分段发酵的条件包括：所述接种后，每隔36～60h补加新的发酵培养基进行补料发酵培养，最后一次补料后发酵108h，得到发酵液；所述补料的次数为1～4次。
7.优选的是，所述接种的量为3～5％。
8.优选的是，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中，37℃培养至od
600
为0.6～1.0。
9.优选的是，所述种子培养液包括牛肉膏2～4g/l、氯化钠4～6g/l和蛋白胨5～15g/l，ph值为7.2。
10.优选的是，所述发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米秸秆酶解液上清液50～200份、酵母膏0.05～0.2份、l
‑
谷氨酸钠0.3～0.7份、kh2po40.05～0.2 份和kcl 0.03～0.07份，ph值为7.2。
11.优选的是，所述玉米秸秆酶解液上清液的制备方法包括以下步骤：将玉米秸秆粉末与纤维素酶和木聚糖酶按照质量比为1～3g：4～8mg：3～7mg混合进行酶解，离心，得到玉米秸秆酶解液上清液；所述酶解的过程中，水的添加量为玉米秸秆粉末质量的30～70倍。
12.优选的是，所述纤维素酶的酶活力为100000u/g，所述木聚糖酶的酶活力为50000u/g。
13.优选的是，所述酶解的温度为55℃，所述酶解的时间为48～84h。
14.优选的是，所述分段发酵的条件为：31～36℃，180r/min。
15.优选的是，所述补加的新的发酵培养基的体积为初始的发酵培养基体积的20％～60％。
16.本发明提供了一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d 产量的方法。本发明以玉米秸秆酶解液为基料制成发酵培养基，以枯草芽孢杆菌为出发菌株进行分段发酵，高效发酵生产杆菌霉素d，操作简单，实用性强且成本低，能够提高枯草芽孢杆菌利用玉米秸秆酶解液基料合成杆菌霉素d的效率。即本发明采用分段发酵方式生产杆菌霉素d，极大提高了杆菌霉素d的产量和生产合成效率，为将来实现杆菌霉素d大规模的工业化应用奠定了科学合理的技术基础，提升了玉米秸秆资源的附加值。
具体实施方式
17.本发明提供了一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d 产量的方法，包括以下步骤：
18.将枯草芽孢杆菌种子液接种于含玉米秸秆酶解液上清液的发酵培养基上，进行分段发酵，取发酵液进行离心、酸沉、旋蒸、干燥，得到杆菌霉素 d；
19.所述分段发酵的条件包括：所述接种后，每隔36～60h补加新的发酵培养基进行补料发酵培养，最后一次补料后发酵108h，得到发酵液；所述补料的次数为1～4次。
20.本发明将枯草芽孢杆菌种子液接种于含玉米秸秆酶解液上清液的发酵培养基上，进行分段发酵。
21.在本发明中，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法优选包括：将枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中，37℃培养至od
600
为0.6～1.0，优选为0.8。在本发明中，所述种子培养液优选包括牛肉膏2～4g/l、氯化钠4～6g/l和蛋白胨5～15g/l，更优选包括牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l和蛋白胨10g/l，ph值为7.2。在本发明中，所述接种的量优选为3％～5％，更优选为5％。所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法能快速促进枯草芽孢杆菌繁殖和生长。
22.在本发明中，所述发酵培养基优选包括以下重量份的组分：玉米秸秆酶解液上清液50～200份、酵母膏0.05～0.2份、l
‑
谷氨酸钠0.3～0.7份、kh2po
4 0.05～0.2份和kcl 0.03～0.07份，ph值为7.2；更优选包括玉米秸秆酶解液上清液100份、酵母膏0.1份，l
‑
谷氨酸钠0.5份、kh2po40.1份和kcl 0.05 份，ph值为7.2。所述枯草芽孢杆菌发酵培养基优选能合理提供碳源、氮源及金属盐，能有效促进枯草芽孢杆菌的发酵。
23.在本发明中，所述玉米秸秆酶解液上清液的制备方法优选包括以下步骤：将玉米秸秆粉末与纤维素酶和木聚糖酶按照质量比为1～3g：4～8mg： 3～7mg，更优选为2g：6mg：5mg混合进行酶解，离心，得到玉米秸秆酶解液上清液；所述酶解的过程中，水的添加量优选为玉米秸秆粉末质量的30～70 倍，更优选50倍。在本发明中，所述纤维素酶的酶活力优选为100000u/g，所述木聚糖酶的酶活力优选为50000u/g。在本发明中，所述酶解的温度优选为55℃，所述酶解的时间优选为48～84h，更优选为72h。本发明所述玉米秸秆酶解液上清液的制备方法能有效酶解玉米秸秆，获得枯草芽孢杆菌发酵生长所需的碳源。
24.本发明所述分段发酵的条件包括：所述接种后，每隔36～60h补加新的发酵培养基进行补料发酵培养，最后一次补料后发酵108h，得到发酵液；所述补料的次数为1～4次。在
本发明中，所述分段发酵的条件优选为：31～36℃，180r/min，更优选为33℃，180r/min。在本发明中，所述补加的新的发酵培养基的体积优选为初始的发酵培养基体积的20％～60％，更优选40％，在本发明中，每次补加为一次性添加上述体积的新的发酵培养基。在本发明中，当所述补料的次数为4次时，所述分段发酵的条件优选为：接种后发酵至60 h时，添加新鲜发酵培养基进行第1段发酵；所述第1段发酵发酵至42h时，向第1段发酵的培养液内添加新鲜发酵培养基进行第2段发酵；所述第2段发酵发酵至39h时，向第2段发酵的培养液中添加新鲜发酵培养基进行第3 段发酵；所述第3段发酵发酵至36h时，向第3段发酵的培养液中添加新鲜发酵培养基进行第4段发酵，所述第4段发酵发酵108h。在本发明中，当所述补料的次数为3次时，所述分段发酵的条件优选为：接种后发酵至60h 时，添加新鲜发酵培养基进行第1段发酵；所述第1段发酵发酵至42h时，向第1段发酵的培养液内添加新鲜发酵培养基进行第2段发酵；所述第2段发酵发酵至39h时，向第2段发酵的培养液中添加新鲜发酵培养基进行第3 段发酵，所述第3段发酵发酵108h。在本发明中，当所述补料的次数为2 次时，所述分段发酵的条件优选为：接种后发酵至60h时，添加新鲜发酵培养基进行第1段发酵；所述第1段发酵发酵至42h时，向第1段发酵的培养液内添加新鲜发酵培养基进行第2段发酵，所述第2段发酵发酵108h。在本发明中，当所述补料的次数为1次时，所述分段发酵的条件优选为：接种后发酵至60h时，添加新鲜发酵培养基进行第1段发酵，所述第1段发酵发酵 108h。在本发明中，所述补料的次数优选为2次，实施例结果表明，补料次数为2次时，发酵生产的杆菌霉素d的效果较好，得到的杆菌霉素d含量为62.45mg/g粗肽，杆菌霉素d产量达到61.63mg/g玉米秸秆。
25.分段发酵后，本发明取发酵液进行离心、酸沉、旋蒸、干燥，得到杆菌霉素d。本发明对所述离心、酸沉、旋蒸和干燥的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规离心、酸沉、旋蒸和干燥条件即可。
26.本发明采用玉米秸秆酶解液基料制成杆菌霉素d发酵培养基，运用分批发酵和补料分批发酵结合的分段发酵方法，能够有效提高枯草芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的效率。
27.下面结合具体实施例对本发明所述的一种基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵提高杆菌霉素d产量的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
28.实施例1
29.选择玉米秸秆，除去灰尘，清洗干净，剪至1～2cm小段，放入电热鼓风干燥箱中，温度控制在85℃，烘干至恒重，粉碎过80目筛，制成玉米秸秆粉末备用。
30.精确称取2.00g玉米秸秆粉末，加入50ml去离子水，121℃热处理20min 后取出，冷却至室温。加入适量纤维素酶(100000u/g)和木聚糖酶(50000u/ g)和去离子水并定容至100ml。酶解条件为液料比为50：1ml/g(酶解液体积/玉米秸秆粉末质量，体积质量比，ml/g)，纤维素酶添加量为6mg和木聚糖酶添加量为5mg，酶解温度为55℃，酶解时间为72h，酶解后，8000r/min 离心10min，得到酶解上清液。向100ml酶解上清液中加入酵母膏0.1g， l
‑
谷氨酸钠0.5g、kh2po40.1g和kcl 0.05g，用1mol/盐酸调至ph 7.2，121℃灭菌20min，制成基于玉米秸秆酶解液基料用于发酵生产杆菌霉素d的发酵培养基。将用于生产杆菌霉素d的枯草芽孢杆菌接种至种子培养基(牛肉膏 3g/l，氯化钠5g/l，蛋白胨10g/l，用1mol/盐酸调至ph 7.2，121℃灭菌 20min)，于37℃培养至od
600
为0.8，得到种子液。按照下述四个步骤，分别进
行零段发酵、一段发酵、二段发酵、三段发酵和四段发酵：
31.零段发酵：按5％的接种量将种子液接入1l发酵培养基中，于33℃， 180r/min进行发酵培养108h，得到第零段发酵的发酵液。
32.一段发酵：按5％的接种量将种子液接入1l发酵培养基中，于33℃， 180r/min进行发酵培养，记为第0段发酵，第0段发酵发酵至60h时，向第0段发酵中添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵 108h，得到第一段发酵的发酵液。
33.二段发酵：按5％的接种量将种子液接入1l发酵培养基中，于33℃， 180r/min进行发酵培养，记为第0段发酵，第0段发酵发酵至60h时，向第0段发酵中添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵，记为第1段发酵，第1段发酵发酵至42h时，向第1段发酵培养液内添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵108h，得到第二段发酵的发酵液。
34.三段发酵：按5％的接种量将种子液接入1l发酵培养基中，于33℃， 180r/min进行发酵培养，记为第0段发酵，第0段发酵发酵至60h时，向第0段发酵中添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵，记为第1段发酵，第1段发酵发酵至42h时，向第1段发酵培养液内添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵，记为第2段发酵，第 2段发酵发酵39h时，进行第3段补料，向第2段发酵培养液内添加新鲜发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵108h，得到第三段发酵的发酵液。
35.四段发酵：按5％的接种量将种子液接入1l发酵培养基中，于33℃， 180r/min进行发酵培养，记为第0段发酵，第0段发酵发酵至60h时，向第0段发酵中添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵，记为第1段发酵，第1段发酵发酵至42h时，向第1段发酵培养液内添加新鲜的发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵，记为第2段发酵，第 2段发酵发酵39h时，进行第3段补料，向第2段发酵培养液内添加新鲜发酵培养基400ml，于33℃，180r/min继续发酵，记为第3段发酵，第3段发酵发酵36h，向第3段发酵培养液内添加新鲜发酵培养基400ml，于33℃， 180r/min继续发酵108h，得到第四段发酵的发酵液。
36.分别取第零段发酵的发酵液、第一段发酵的发酵液、第二段发酵的发酵液、第三段发酵的发酵液和第四段发酵的发酵液40.0ml于6000r/min离心 15min，弃菌体，取上清液，用hcl将上清液ph调至2.0，室温静置4h，6000 r/min离心15min，取沉淀，60℃烘干至恒重，制成杆菌霉素d干燥粗肽固体，研成粉末。取50mg杆菌霉素d干燥粗肽粉末，加入1.0ml甲醇进行萃取，10000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱(hplc)法对获得的杆菌霉素d含量进行测定(具体hplc条件和测定方法：进样量20μl，柱温25℃，检测波长207nm，流速0.6ml/min，a:乙腈+0.1％三氟乙酸，b：超纯水+0.1％三氟乙酸)。不同发酵方式条件下测得的杆菌霉素d结果见表1，不难发现，采用第二段发酵的发酵液中杆菌霉素d产量最高，得到的杆菌霉素d含量为62.45mg/g粗肽，杆菌霉素d产量达到61.63mg/g玉米秸秆，和第0段发酵相比，分别提高了1.63倍和2.02倍。由此可见，采用基于玉米秸秆酶解液基料分段发酵使杆菌霉素d的产量得到了显著提高，其中，补料的次数为2次时效果最好，即第二段发酵的发酵液中产物产量最高。
37.表1不同发酵方式条件下测得的杆菌霉素d结果
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。