利用荧光定量PCR检测ZNF384基因重排的引物和探针及试剂盒的制作方法

利用荧光定量pcr检测znf384基因重排的引物和探针及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及一种临床检验用途的基因检测方法，采用探针实时荧光pcr技术，能够对人类b
‑
all中znf384基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。


背景技术：

2.b细胞急性淋巴细胞白血病(b
‑
all)是一种可致命的血液癌症，其癌细胞通常多次发生染色体结构突变，包括非整倍体和基因重排等，导致部分原癌基因的表达失去控制或者产生某些功能异常的融合蛋白。这些融合蛋白的形成常常会影响血细胞分化、染色体重塑、细胞分裂等过程，成为癌变的重要推手。b
‑
all占儿童急性淋巴细胞白血病(all)的85％～90％，占成人all的75％。大部分儿童患者可通过正规化疗获得长期无病生存，5年无病生存率约为80％，而成人的预后明显比儿童差，其5年无病生存率仅为40％。65％～80％的all患者可检测出克隆性染色体畸变，其中66％为特异性染色体重排，许多常见重排往往是致病的主要遗传因素。
3.znf384基因编码一种转录因子，可结合并调节细胞外基质基因mmp1、mmp3、mmp7及col1a1的启动子。znf384基因重排常见于伴髓系抗原表达的b
‑
all患者，分别占儿童和成人b
‑
all的3％～4％和7％。常见的累及znf384基因重排的对手基因包括tcf3、taf15及ewsr1等。伴有znf384基因重排的b
‑
all患者预后中等，可上调clcf1及btla基因表达水平，激活了jak
‑
stat信号通路，可能对jak
‑
stat通路抑制剂敏感。znf384基因位于12p13.31，由10个外显子组成，编码516个氨基酸。tcf3基因位于19p13，由19个外显子组成，与znf384基因重排有五种：tcf3 ex11
‑
znf384 ex3、tcf3ex13
‑
znf384 ex3、tcf3 ex13
‑
znf384 ex2、tcf3 ex16
‑
znf384 ex2、tcf3ex17
‑
znf384 ex7。taf15基因位于17q12，与znf384基因主要有两种重排：taf15 ex6
‑
znf384 ex3和taf15 ex9
‑
znf384 ex3。ewsr1基因位于22q12，与znf384基因有两种重排：ewsr1 ex7
‑
znf384 ex3和ewsr1 ex7
‑
znf384ex2。
4.znf384重排检测的常用技术有荧光原位杂交技术(fish)、rq
‑
pcr等方法。fish检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。rq
‑
pcr采用taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在pcr反应管封闭状态下进行，解决了pcr产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对pcr产物的准确定量，易于统一标准，与定性pcr技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足znf384基因重排的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量pcr中常见的方法有sybr greeni染料法，双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybr greeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光pcr技术结合
taqman探针法应用于znf384的基因重排检测。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本项目探讨一种基于实时荧光pcr的方法，能够筛查血液病相关znf384基因重排的九种形式，加强对b
‑
all的认识，可应用于该型白血病的早期检测、疗效评价和复发风险的判断，对促进b
‑
all发病机制的理解、开发针对性的靶向治疗及促进精准医疗具有重要意义。
6.本发明公开了一种利用荧光定量pcr检测znf384基因重排的引物和探针及试剂盒，能够对人类b
‑
all中znf384基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
7.利用荧光定量pcr检测znf384基因重排的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的碱基序列如下：
8.tcf3 exon 11
‑
f:gcatcctccttctcctcagc
9.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
10.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
11.tcf3 exon 13
‑
f:aagcaataacttctcgtccagc
12.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
13.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
14.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
15.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
16.tcf3 exon 13
‑
r:cggatcactcaagcaataactt
17.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
18.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
19.tcf3 exon 16
‑
r:ccagcctcatgcacaacc
20.taf15 exon 6
‑
f:gggaaaactacagccaccac
21.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
22.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
23.taf15 exon 9
‑
f:attatggacccagaacagatgc
24.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
25.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
26.ewsr1 exon 7
‑
3f:tcctacagccaagctccaagt
27.nf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
28.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
29.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
30.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
31.ewsr1 exon 7
‑
2r:gatcctacagccaagctccaa。
32.进一步地，所述引物和探针还包括检测abl内参基因的引物和探针，分别为：
33.abl
‑
f:gatacgaagggagggtgtacca
34.abl
‑
r:ctcggccagggtgttgaa
35.abl
‑
probe:fam
‑
tgcttctgatggcaagctctacgtctcct
‑
bhq1。
36.本发明还提供一种利用荧光定量pcr检测znf384基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：rna提取试剂、逆转录试剂、检测体系pcr反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系pcr反应液包括：
37.(1)检测目的基因用上下游引物以及探针，其序列如下：
38.tcf3 exon 11
‑
f:gcatcctccttctcctcagc
39.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
40.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
41.tcf3 exon 13
‑
f:aagcaataacttctcgtccagc
42.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
43.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
44.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
45.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
46.tcf3 exon 13
‑
r:cggatcactcaagcaataactt
47.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
48.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
49.tcf3 exon 16
‑
r:ccagcctcatgcacaacc
50.taf15 exon 6
‑
f:gggaaaactacagccaccac
51.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
52.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
53.taf15 exon 9
‑
f:attatggacccagaacagatgc
54.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
55.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
56.ewsr1 exon 7
‑
3f:tcctacagccaagctccaagt
57.nf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
58.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
59.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
60.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
61.ewsr1 exon 7
‑
2r:gatcctacagccaagctccaa
62.(2)检测abl内参基因的上、下游引物以及探针，其序列如下：
63.abl
‑
f:gatacgaagggagggtgtacca
64.abl
‑
r:ctcggccagggtgttgaa
65.abl
‑
probe:fam
‑
tgcttctgatggcaagctctacgtctcct
‑
bhq1。
66.进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为含znf384融合基因溶液；阴性对照品为不含znf384融合基因溶液。
67.本发明将实时荧光pcr技术结合采用tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和znf384目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内znf384基因重排情况。相比于以往的fish和
△△
ct法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。该方法经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上b
‑
all患者体内znf384基因重排的检测，对于分型诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要
意义。
附图说明
68.图1检测11例正常样本，都没有发现融合基因。图1为正常样本tcf3ex11
‑
znf384 e3融合检测曲线
69.图2检测11例b
‑
all临床样本发现疑是融合基因一例，图2为临床样本疑是ewsr1 e7
‑
znf384 e3融合的检测曲线
具体实施方式
70.实施例1
71.本发明用于辅助临床上b
‑
all的分型诊断及个体化治疗方案制定的方法。主要包括以下试剂：红细胞裂解液；trizol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；
72.检测体系pcr反应液：revertra ace qpcr rt kit(toyobo公司)；thunderbird probe qpcr mix(2
×
)、abl内参基因及mef2d目的基因的引物和探针均为10μm；
73.其中检测内参基因abl和目的基因znf384的引物和探针，分别为：
74.tcf3 exon 11
‑
f:gcatcctccttctcctcagc
75.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
76.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
77.tcf3 exon 13
‑
f:aagcaataacttctcgtccagc
78.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
79.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
80.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
81.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
82.tcf3 exon 13
‑
r:cggatcactcaagcaataactt
83.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
84.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
85.tcf3 exon 16
‑
r:ccagcctcatgcacaacc
86.taf15 exon 6
‑
f:gggaaaactacagccaccac
87.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
88.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
89.taf15 exon 9
‑
f:attatggacccagaacagatgc
90.znf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
91.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
92.ewsr1 exon 7
‑
3f:tcctacagccaagctccaagt
93.nf384 exon 3
‑
p:fam
‑
tctggccttctatccccacagtctc
‑
tamra
94.znf384 exon 3
‑
r:acattgtgttctcgatctgacct
95.znf384 exon 2
‑
f:tctcttcctcctgccgtctt
96.znf384 exon 2
‑
p:fam
‑
attccttctcctttccagggctcc
‑
tamra
97.ewsr1 exon 7
‑
2r:gatcctacagccaagctccaa
98.abl
‑
f:gatacgaagggagggtgtacca
99.abl
‑
r:ctcggccagggtgttgaa
100.abl
‑
probe:fam
‑
tgcttctgatggcaagctctacgtctcct
‑
tamra
101.阳性对照品：含znf384基因组的溶液；
102.阴性对照品：不含znf384基因组的溶液。
103.实施例2
104.本发明方法的操作流程：
105.(1)抽提血液中的总rna：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml trizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10
‑
15min，加入20ulrnase
‑
free水溶解沉淀。
106.(2)参考toyobo公司的rever tra ace qpcr rt kit试剂盒说明书，将rna反转为cdna。
107.(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份23μl分装：
108.x＝23μl反应液
×
(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
109.(4)加样：加入检测体系pcr反应液中2μl cdna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
110.(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国applied biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，60℃40sec40个循环，荧光信号于60℃40sec时采集。
111.(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。
112.1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
113.2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。
114.实施例3
115.采用本发明核酸检测方法检测健康体检人群标本和临床b细胞急性淋巴细胞白血病(b
‑
all)样品各11例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
116.每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测22份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为70分钟。22例筛查样本中所有样本的abl均起线，阳性对照起线；正常样本中未发现tcf3ex11
‑
znf384 e3,tcf3 ex13
‑
znf384 e3,tcf3 ex13
‑
znf384 e2,tcf3e16
‑
znf384e2,taf15 e6
‑
znf384 e3,taf15 e9
‑
znf384 e3,ewsr1e7
‑
znf384 e3,ewsr1 e7
‑
znf384 e2这8种融合存在；由于这些融合基因比较罕见，所
以在b
‑
all临床样本中只发现一例疑是ewsr1 e7
‑
znf384 e3融合的样本，其他未检测到融合基因的存在，疑似病例的样本检测图件见图2。
117.本发明的利用荧光定量pcr检测znf384基因重排的引物和探针及试剂盒，能够对人类b
‑
all中znf384基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。