一种白刺多糖的制备方法

1.本发明具体涉及一种白刺多糖的制备方法。


背景技术：

2.白刺(nitraria tangutorun bobr)是蒺藜科白刺属，其果实药食同源，富含多糖，研究表明白刺果多糖有免疫调节和抗氧化等生物活性，具有巨大的开发利用价值。
3.传统白刺多糖提取方法是采用乙醇沉淀法制得粗制多糖，再用柱层析提纯，由于过程工艺复杂、能耗大、有机试剂用量大，并不适用于工业化大生产。马群，唐古特白刺多糖提取、修饰及免疫活性研究[d],西安.陕西师范大学,2018,公开了一种改进的白刺多糖提取纯化方法，虽然是用热水浸提，大孔树脂脱色脱蛋白，工艺简单，未大量使用有机溶剂，但由于浸提时添加了酶，使生产成本提高，其得到的白刺多糖收率低，纯度不高，也无法将其转化用于工业化生产。


技术实现要素：

[0004]
为解决上述问题，本发明提供了一种白刺多糖的纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：
[0005]
取白刺果提取液，经过微滤，大孔树脂脱色，再经超滤，纳滤，即得白刺多糖。
[0006]
进一步地，所述微滤是用孔径为0.05～0.2μm的微滤膜过滤，微滤膜优选 0.1μm；所述用微滤膜过滤的压力为0.2
‑
0.4mpa。
[0007]
进一步地，所述大孔树脂脱色是微滤后的滤膜透过液以流速1
‑
2bv/h上样于大孔树脂柱，再用3
‑
5bv的水以流速1
‑
2bv/h清洗。
[0008]
更进一步地，所述大孔树脂为dm21d或x
‑
5大孔树脂；所述水为去离子水。
[0009]
进一步地，所述超滤次数为2～3次；所述超滤2次是大孔树脂脱色后的层析液在压力0.25
‑
0.75mpa过截留分子量100000da超滤膜，再用水清洗截留液至透过液无多糖，透过液再在压力0.1
‑
0.2mpa过截留分子量3000da超滤膜。
[0010]
进一步地，所述纳滤是超滤后的透过液在压力1.5
‑
2.5mpa过截留分子量 300da超滤膜。
[0011]
进一步地，所述超滤或纳滤的循环液控温为20
‑
40℃。
[0012]
本发明还提供了一种白刺多糖的制备方法，它包括如下步骤：
[0013]
1)取白刺果，加水浸泡12
‑
24小时，去果皮提取，提取液抽滤，离心；
[0014]
2)取步骤1)所得上清液，按前述方法纯化，冷冻干燥，即得。
[0015]
进一步地，步骤1)所述白刺果与水的质量体积比为1g：6～7ml；所述水为蒸馏水。
[0016]
进一步地，步骤1)所述提取为浸提，浸提温度为70～90℃，优选80℃，次数2次，每次1～2h；所述离心速度7000～9000r/min，时间0.2～1小时，优选离心速度8000r/min，时间0.5小时；所述冷冻干燥的时间为48～60h，温度
ꢀ‑
40℃以下。
[0017]
本发明白刺多糖的制备方法，通过特定的工艺步骤，精准的参数控制可有效地保
留多糖成分，得到安全、纯度高的白刺多糖。经试验证明，本发明提取方法操作简单方便，分离提纯得到的白刺多糖纯度大于60％，总收率大于45％。适于工业化大生产。
[0018]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0020]
实施例1、本发明白刺多糖的制备
[0021]
1.提取：称取580g质量白刺果(干品),加入3600ml蒸馏水,浸泡12小时，去除果皮。在80℃条件下提取2小时，提取次数为2次。将2次得到提取液合并，经过抽滤、离心(8000r/min，0.5小时)，得到提取液。
[0022]
2.微滤膜：将步骤1)的白刺果提取液通过微滤膜系统进行过滤，除去固形物，得到滤膜透过液。微滤操作参数为：压力为0.2mpa，温度为常温。
[0023]
3.大孔树脂脱色：
[0024]
选择dm21d大孔树脂进行脱色，提前对大孔树脂进行预处理操作(浸泡、酸洗、碱洗、冲洗)，后将树脂装入层析柱。进样为微滤膜透过液，控制上样流速为1bv/h,。当进料完成，使用去离子水清洗，清洗流速为1bv/h，用量为3bv，层析柱多糖清洗完成，获得层析液。
[0025]
4.超滤膜(分子量为100000da)
[0026]
将步骤3)层析液通过超滤膜(分子量为100000da)进行分离纯化，去除大分子杂质，如蛋白质、果胶、纤维素等。操作参数为：压力为0.25mpa，循环液控温20℃。进料完成后，加入去离子水清洗截留液，回收残留多糖，直至透过液检测无多糖时停止(采用本领域公知的苯酚硫酸法检测多糖含量)。
[0027]
5.超滤膜(分子量为3000da)
[0028]
将步骤4)透过液通过超滤膜(分子量为3000da)进行分离纯化，去除小分子杂质，如单糖、寡糖、氨基酸等。操作参数为：压力为0.1mpa，循环液控温20℃。
[0029]
6.纳滤膜(分子量为300da)
[0030]
将步骤5)截留液通过纳滤膜(分子量为300da)进行浓缩，并去除无机盐等杂质，操作参数为：压力为1.5mpa，循环液控温20℃。浓缩倍数为 4
‑
10倍。7.冷冻干燥
[0031]
将浓缩液放入冷冻干燥机干燥，
‑
40℃以下干燥48h。干燥后，快速装入密封袋低温避光干燥保存。最终测得多糖收率为46％，多糖含量为60％。
[0032]
实施例2、本发明白刺多糖的制备
[0033]
1.提取：称取580g质量白刺果(干品),加入3600ml蒸馏水,浸泡12小时，去除果皮。在80℃条件下提取2小时，提取次数为2次。将2次得到提取液合并，经过过滤、离心(8000r/min，0.5小时)步骤，得到提取液。
[0034]
2.微滤膜：将步骤1)的白刺果提取液通过微滤膜系统进行过滤，除去固形物，得到滤膜透过液。微滤操作参数为：压力为0.3mpa，温度为常温。
[0035]
3.大孔树脂脱色：
[0036]
选择x
‑
5大孔树脂进行脱色，提前对大孔树脂进行预处理操作(浸泡、酸洗、碱洗、冲洗)，后将树脂装入层析柱。进样为微滤膜透过液，控制上样流速为1.5bv/h,当进料完成，使用去离子水清洗，清洗流速为1.5bv/h，用量为4bv获得层析液。
[0037]
4.超滤膜(分子量为100000da)
[0038]
将步骤3)层析液通过超滤膜(分子量为100000da)进行分离纯化，去除大分子杂质，如蛋白质、果胶、纤维素等。操作参数为：压力为0.5mpa，循环液控温30℃。进料完成后，加入去离子水清洗截留液，回收残留多糖，直至透过液基本无多糖时停止。
[0039]
5.超滤膜(分子量为3000da)
[0040]
将步骤4)透过液通过超滤膜(分子量为3000da)进行分离纯化，去除小分子杂质，如单糖、寡糖、氨基酸等。操作参数为：压力为0.15mpa，循环液控温30℃。
[0041]
6.纳滤膜(分子量为300da)
[0042]
将步骤5)截留液通过纳滤膜(分子量为300da)进行浓缩，并去除无机盐等杂质，操作参数为：压力为2.0mpa，循环液控温30℃。浓缩倍数为 4
‑
10倍。
[0043]
7.冷冻干燥
[0044]
将浓缩液放入冷冻干燥机干燥，
‑
40℃以下干燥时长为50h。干燥后，快速装入密封袋低温避光干燥保存。最终测得多糖收率为48％，多糖含量为 63.9％。
[0045]
实施例3、本发明白刺多糖的制备
[0046]
1.提取：称取580g质量白刺果(干品),加入3600ml蒸馏水,浸泡12小时，去除果皮。在80℃条件下提取2小时，提取次数为2次。将2次得到提取液合并，经过过滤、离心(8000r/min，0.5小时)步骤，得到提取液。
[0047]
2.微滤膜：将处理好的白刺果提取液通过微滤膜系统进行过滤，除去固形物，得到滤膜透过液。微滤操作参数为：压力为0.4mpa，温度为常温。
[0048]
3.大孔树脂脱色：
[0049]
选择dm21d或x
‑
5大孔树脂进行脱色，提前对大孔树脂进行预处理操作(浸泡、酸洗、碱洗、冲洗)，后将树脂装入层析柱。进样为微滤膜透过液，控制上样流速为2bv/h,。当进料完成，使用去离子水清洗，清洗流速为 1
‑
2bv/h，用量为5bv，获得层析液。
[0050]
4.超滤膜(分子量为100000da)
[0051]
将上一步层析液通过超滤膜(分子量为100000da)进行分离纯化，去除大分子杂质，如蛋白质、果胶、纤维素等。操作参数为：压力为0.75mpa，循环液控温40℃。进料完成后，加入去离子水清洗截留液，回收残留多糖，直至透过液基本无多糖时停止。
[0052]
5.超滤膜(分子量为3000da)
[0053]
将上一步透过液通过超滤膜(分子量为3000da)进行分离纯化，去除小分子杂质，如单糖、寡糖、氨基酸等。操作参数为：压力为0.2mpa，循环液控温40℃。
[0054]
6.纳滤膜(分子量为300da)
[0055]
将上一步截留液通过纳滤膜(分子量为300da)进行浓缩，并去除无机盐等杂质，操作参数为：压力为2.5mpa，循环液控温40℃。浓缩倍数为4
‑
10 倍。
[0056]
7.冷冻干燥
[0057]
将浓缩液放入冷冻干燥机干燥，
‑
40℃以下干燥时长为60h。干燥后，快速装入密封袋低温避光干燥保存。最终测得多糖收率为46％，多糖含量为66％。
[0058]
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
[0059]
试验例 白刺多糖制备
[0060]
1、本发明白刺多糖提取
[0061]
1.1具体工艺流程：
[0062]
前期研究显示用大孔树脂与滤膜过滤结合纯化白刺提取液，能提高终产品白刺多糖的质量，但纯化步骤的顺序会显著影响多糖的收率和纯度，在经不断尝试后，最终确定了如下白刺多糖制备的工艺流程：
[0063]
白刺果
→
提取
→
微滤膜
→
大孔树脂脱色
→
超滤膜(分子量为100000da)
ꢀ→
超滤膜(分子量为3000da)
→
纳滤膜(分子量为300da)
→
冷冻干燥
→
多糖成品
[0064]
1.2具体制备方法
[0065]
同实施例1，
[0066]
2、对比方法
[0067]
2.1工艺流程：
[0068]
白刺果
→
提取
→
醇沉
→
sevage除蛋白
→
大孔树脂脱色
→
冷冻干燥
→
多糖成品；
[0069]
2.2具体制备方法：
[0070]
1)提取：称取580g质量白刺果(干品)，加入3600ml蒸馏水,浸泡12 小时，去除果皮。在80℃条件下提取2小时，提取次数为2次。将2次得到提取液合并，经过抽滤、离心(8000r/min，0.5小时)，得到提取液。,
[0071]
2)醇沉：取提取液，用80％的乙醇醇沉，过夜取沉淀粗多糖，后用水溶解至无沉淀。
[0072]
3)脱蛋白：取粗多糖溶液300ml,与100mlsveag试剂(3:l比例)混合,分液漏斗中充分振荡30分钟，静置3
‑
6小时分层。下层白色沉淀为蛋白层，分液除去。
[0073]
4)脱色：选择dm21d或x
‑
5大孔树脂进行脱色，提前对大孔树脂进行预处理操作(浸泡、酸洗、碱洗、冲洗)，后将树脂装入层析柱。进样为脱蛋白后的溶液，控制上样流速为2bv/h,。当进料完成，使用去离子水清洗，清洗流速为2bv/h，获得层析液。
[0074]
5)冷冻干燥：将浓缩液放入冷冻干燥机干燥，
‑
40℃以下干燥时长为60h。干燥后，快速装入密封袋低温避光干燥保存。
[0075]
3、检测
[0076]
3.1检测方法
[0077]
使用苯酚
‑
硫酸法检测上述三种方法提取得到的中间品白刺提取液以及成品白刺多糖冻干粉中多糖的含量，其中苯酚
‑
硫酸法的检测步骤如下：
[0078]
1).制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖10mg于100ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入5％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
[0079]
2).取多糖样品加蒸馏水溶解或稀释得溶液，取2ml溶液加入5％苯酚 1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，在涡旋仪上震荡，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖含量。
[0080]
3)计算各方法下白刺多糖的收率和纯度
[0081]
收率＝成品中多糖质量/提取液中多糖质量*100％
[0082]
纯度＝成品中多糖质量/成品中多糖质量*100％
[0083]
4、检测结果
[0084]
4.1产品对比
[0085]
各方法制备的白刺多糖检测结果见表1
[0086]
表1 白刺多糖检测结果对比
[0087][0088]
从表1可见：本发明多糖收率和成品多糖纯度较高，并且过程中使用有机试剂少，能耗低。
[0089]
4.2工艺对比：
[0090]
具体工艺流程对比见表2
[0091]
从表2可见：对比组1虽然工艺步骤较简单，但由于采用了醇沉和sevage除蛋白步骤，引入了大量有机试剂，安全性低且成本高，并不适合大生产，且得到的多糖纯度仅40％左右，收率也仅30％左右；本发明将大孔树脂脱色与膜分离结合，避免了有机溶剂的大量使用，同时提高了白刺多糖的收率和纯度，由于绿色环保，高效，适合放大生产。综上，通过特定的工艺步骤，精准的参数控制可有效地保留多糖成分，得到安全、纯度高的白刺多糖。经试验证明，本发明提取方法操作简单方便，分离提纯得到的白刺多糖纯度大于60％，总收率大于45％。适于工业化大生产。