水中肠球菌酶底物法测定剂及其制备方法与流程

1.本发明属于水污染检测技术领域，具体来说涉及一种水中肠球菌酶底物法测定剂，以及对该水中肠球菌酶底物法测定剂的制备方法。


背景技术：

2.肠球菌为广泛存在自然界中，一般存在于各种温血和冷血动物和人类的粪便中，在人类粪便中数量仅次于大肠菌群的存在，肠球菌可引起心内膜炎、胆囊炎、脑膜炎、等多种疾病，也是判断水体是否遭受粪便污染的重要指标；目前我国对于水中肠球菌的检测方法，主要为细菌培养方法，即膜过滤法；使用培养基将检测水样中通过营养物经过41℃培养，48小时后得出结果。该方法属于微生物检测的传统方法，需要在实验前期做大量的培养基配置工作，已经不能满足于当前我国的公共卫生检测要求，因此如何开发一种通过酶底物方法，主要针对水中的肠球菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度，是本领域技术人员需要研究的方向。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种水中肠球菌酶底物法测定，其能够针对水中的肠球菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度。
4.其采用的技术方案如下：
5.根据本发明的一个方面，提供一种水中肠球菌酶底物法测定剂，其包括以下重量份的组分：10～12份的ph调节剂；9.4～10份的指示剂；5.62～8.14份的抑制剂；3.5～5.8份的生产剂，其中，所述生产剂由3～5份的蛋白胨构成。
6.优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂中：所述ph调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾。
7.更优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂中：所述指示剂由0.3～0.5份的4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷、6.3～6.5份的4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸构成。
8.更优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂中：所述抑制剂由为0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成。
9.根据本发明的另一个方面，提供了一种制备上述水中肠球菌酶底物法测定剂的制备方法。
10.其包括如下步骤：
11.s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至55℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
12.s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
13.s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
14.s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2小时，制得水中肠球菌酶底物法测定剂干粉型成品。
15.优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂制备方法中：测定剂包括以下重量份的组分：ph调节剂10～12份；指示剂9.4～10份；抑制剂5.62～8.14份；蛋白胨3～5份。
16.优选的，所述ph调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾；所述指示剂由4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷、4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸和n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸构成；所述抑制剂由硫酸镁、硫酸铵、羧苄青霉素二钠和硫酸锰构成。
17.更优选的，所述氯化钠为6份，所述磷酸氢二钾为4份，所述4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷为0.4份，所述4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸为6.4份，所述n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸为2.9份，所述硫酸镁为0.65份，所述硫酸铵为5份，所述羧苄青霉素二钠为0.2份，所述硫酸锰为0.03份，所述蛋白胨为4.6份。
18.相对于现有技术，本发明能够对饮用水、自来水、污水中的肠球菌实现快速检测。可配合市面上根据的51孔、97孔定量盘和mpn表格使用，可达到24小时定性定量的检测结果，不但提高了检测效率，减少了人工成本而且还降低了使用人员和环境的污染。此外，本产品可在121℃灭菌后按企业要求进行废弃处理。相对于现有产品减少了企业的环保成本。
19.与现有技术相比，本发明能够有效降低使用人员和环境的污染，针对水中的肠球菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度。
具体实施方式
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
21.根据本发明的一种典型的实施方式，提供一种水中肠球菌酶底物法测定剂，其包括以下重量份的组分：10～12份的ph调节剂；9.4～10份的指示剂；5.62～8.14份的抑制剂；3.5～5.8份的生产剂。其中，所述生产剂由3～5份的蛋白胨构成。
22.应用本发明的技术方案，通过酶底物方法，利用指示剂，当酶底物被肠球菌代谢时，经过41℃培养24小时后，样品在366nm波长紫外灯下，产生蓝色荧光，能实现对水中的肠球菌进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度，减少了人工成本而且还降低了使用人员和环境的污染。
23.优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂中：所述ph调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾。
24.更优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂中：所述指示剂由0.3～0.5份的4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷、6.3～6.5份的4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸构成。通过酶底物方法，利用4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷作为指示剂，当酶底物被肠球菌代谢时，经过41℃培养24小时后，样品在366nm波长紫外灯下，产生蓝色荧光。针对水中的肠球菌进行快速的微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度。
25.更优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂中：所述抑制剂由为0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成。
26.根据本发明的另一种典型的实施方式，提供一种制备上述水中肠球菌酶底物法测
定剂的制备方法。
27.其包括如下步骤：
28.s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至55℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
29.s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
30.s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
31.s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2小时，制得水中肠球菌酶底物法测定剂干粉型成品。
32.优选的，上述水中肠球菌酶底物法测定剂制备方法中：包括以下重量份的组分：ph调节剂10～12份；指示剂9.4～10份；抑制剂5.62～8.14份；蛋白胨3～5份。
33.优选的，所述ph调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾；所述指示剂由4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷、4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸和n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸构成；所述抑制剂由硫酸镁、硫酸铵、羧苄青霉素二钠和硫酸锰构成。
34.更优选的，所述氯化钠为6份，所述磷酸氢二钾为4份，所述4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷为0.4份，所述4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸为6.4份，所述n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸为2.9份，所述硫酸镁为0.65份，所述硫酸铵为5份，所述羧苄青霉素二钠为0.2份，所述硫酸锰为0.03份，所述蛋白胨为4.6份。通过发明人反复试验，发现这一重量份组分所制成的水中肠球菌酶底物法测定剂，检测效率最好、检测灵敏度最高。
35.下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果，本发明中未明确写明操作步骤的，可以采用现有技术的手段实现。
36.实施例1：
37.一种水中肠球菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
38.7份的氯化钠,3份磷酸氢二钾，0.3份的4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷，6.3份的4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸，2.8份的n
‑
(2
‑
羟乙羟)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸，0.5份的硫酸镁，5份的硫酸铵，0.1份的羧苄青霉素二钠，0.02份的硫酸锰，3.5份的蛋白胨。
39.其制备过程如下：
40.s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至55℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
41.s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
42.s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
43.s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨、持续搅拌2小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中肠球菌酶底物法测定剂干粉型成品。
44.对比例1
45.取1.5份的实施例1成品投入100ml水样中进行检测。同时通过肠球菌阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比试验，该对比试验检测结果如表1所示：
[0046][0047][0048]
表1
[0049]
基于上述对比试验证明，采用实施例1所提供的水中肠球菌酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在24小时肠球菌达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合肠球菌阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比，可得出结论，水中肠球菌酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
[0050]
实施例2：
[0051]
一种水中肠球菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
[0052]
8份的氯化钠，4份磷酸氢二钾，0.4份的4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷，6.4份的4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸，2.9份的n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸，0.65份的硫酸镁，5份的硫酸铵，0.2份的羧苄青霉素二钠，0.03份的硫酸锰，4.6份的蛋白胨。
[0053]
其制备过程如下：
[0054]
s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至65℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
[0055]
s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
[0056]
s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
[0057]
s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨持续搅拌2小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中肠球菌酶底物法测定剂干粉型成品。
[0058]
对比例2
[0059]
取1.5份的实施例1成品投入100ml水样中进行检测。同时通过肠球菌阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比对比试验，该对比试验检测结果如表2所示：
[0060]
[0061][0062]
表2
[0063]
基于上述对比试验证明，采用实施例1所提供的水中肠球菌酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在24小时肠球菌达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合肠球菌阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比，可得出结论，水中肠球菌酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
[0064]
实施例3：
[0065]
一种水中肠球菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
[0066]
9份的氯化钠，2份磷酸氢二钾，0.5份的邻硝基苯β
‑
d
‑
半乳吡喃糖苷，6.5份的4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸，3.0份的n
‑
(2
‑
羟乙羟)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸，0.8份的硫酸镁，7份的硫酸铵，0.3份的羧苄青霉素二钠，0.04份的硫酸锰，5份的蛋白胨。
[0067]
其制备过程如下：
[0068]
s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至55℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
[0069]
s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
[0070]
s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
[0071]
s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨、持续搅拌2小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中肠球菌酶底物法测定剂干粉型成品。
[0072]
对比例3
[0073]
取1.5份的实施例1成品投入100ml水样中进行检测。同时通过肠球菌阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比试验，该对比试验检测结果如表3所示：
[0074]
[0075]
表3
[0076]
基于上述对比试验证明，采用实施例1所提供的水中肠球菌酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在24小时肠球菌达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合肠球菌阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比，可得出结论，水中肠球菌酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
[0077]
终上所述，计量按最低(实例1)、中间值(实例2)、最高(实例3)分别进行试验比对得出结论，计量在添加值在实例2中表现最好，超过中间值到最高值(实例3)对结果影响不大，试验效率上没有明显提升。
[0078]
实施例4
[0079]
一种水中肠球菌酶底物法测定剂，其原料包括组分：
[0080]
6份的氯化钠，4份磷酸氢二钾，0.4份4
‑
甲基伞形酮
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸苷，6.4份的4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸，2.9份的n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑2‑
乙烷磺酸，0.65份的硫酸镁，5份的硫酸铵，0.2份的羧苄青霉素二钠，0.03份的硫酸锰，4.6份的蛋白胨。
[0081]
其制备过程如下：
[0082]
s1：分别将ph调节剂和指示剂加热至55℃、直至ph调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
[0083]
s2：将s1所得ph调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至ph调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于50目；
[0084]
s3：将s2所得ph调节剂和指示剂搅拌混匀、得ph调节剂和指示剂的混合粉末；
[0085]
s4：对s3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨、持续搅拌2小时，随后控制在30℃以下停机放料、制得水中肠球菌酶底物法测定剂干粉型成品。
[0086]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过酶底物方法，利用指示剂，当酶底物被肠球菌代谢时，样品在366nm波长紫外灯下，产生蓝色荧光，实现针对水中的肠球菌进行快速的微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度，减少污染和人工浪费。
[0087]
以上所述，仅为本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书的保护范围为准。