一株施氏假单胞菌DN-1及其应用的制作方法

一株施氏假单胞菌dn-1及其应用
技术领域
1.本发明属于环境微生物学技术领域，具体涉及一株施氏假单胞菌dn-1及其应用。


背景技术：

2.目前，我国大部分油田采用注水采油工艺，随着开发进入中后期，采出液的含水率不断升高，微生物腐蚀越发严重。微生物生长、代谢及繁殖可引起设备、管线和其他金属材料的严重腐蚀，并堵塞管道，伤害油层，导致注水压力上升，石油产量、油气质量下降，为油田生产带来极大的危害。造成金属材料腐蚀的微生物主要是参与自然界硫、铁元素循环的细菌，即厌氧的硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,srb)和好氧的铁细菌及硫杆菌。
3.油田杀灭srb主要采用物理杀菌法和化学杀菌法。物理杀菌法对游离的srb杀灭效果显著，但由于作用距离的限制，对远距离的srb或附着型的srb难以达到杀灭效果。化学杀菌法中，广泛使用的杀菌剂主要有季胺盐、醛类、杂环类以及它们的复配物，但由于srb常与其他微生物共存于微生物产生的多糖胶中而被保护起来，杀菌剂不易穿透。化学杀菌法中，对于一般的氧化型杀菌剂而言，还由于微生物处于硫化氢的还原性环境中，杀菌剂很难起到有效的杀菌效果；生物膜的存在，使杀菌效率降低、甚至失效，以至于产生耐药菌。
4.生物法是通过生物竞争作用抑制srb活性的方法，改变以往的单纯追求以杀灭srb数量为目的传统思维模式，转而以抑制srb活性为目的，是油田系统控制硫化物危害方面观念的变革和方法的创新，在我国油田系统中运用较少。通过向油层中加入合适的反硝化菌，利用反硝化菌能够优先利用srb赖以生存的主要碳源，从而迅速生长繁殖，影响srb还原硫酸盐，达到抑制srb的目的。


技术实现要素：

5.发明目的：针对上述现有技术的不足，本发明提供一株施氏假单胞菌dn-1及其应用。
6.技术方案：一株施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1，其保藏编号为cgmcc no.22969。
7.一种菌剂，所述菌剂的活性成分为上述的施氏假单胞菌。
8.一种菌剂，包括上述的施氏假单胞菌和营养培养基。
9.进一步地，所述营养培养基为葡萄糖1-8g/l，甲醇1.5-3.0g/l，乙酸钠0.5-2.5g/l，硝酸钠0.6-2.0g/l，磷酸二氢钾1-3g/l，酵母粉0.2-0.8g/l，氯化钠3-8g/l，ph值为7～8。
10.更进一步的，所述营养培养基为葡萄糖2-5g/l，甲醇2-2.5g/l，乙酸钠1.5-2.0g/l，硝酸钠0.8-1.5g/l，磷酸二氢钾1.2-2.0g/l，酵母粉0.3-0.5g/l，氯化钠3-5g/l，ph值为7～8。
11.物质ⅰ和/或物质ⅱ和/或物质ⅲ在油田含油污水处理中的应用；
12.物质ⅰ为上述的施氏假单胞菌；
13.物质ⅱ为上述的菌剂；
14.物质ⅲ为上述的施氏假单胞菌的发酵液。
15.物质ⅰ和/或物质ⅱ和/或物质ⅲ在油井采出液处理中的应用；
16.物质ⅰ为上述的施氏假单胞菌；
17.物质ⅱ为上述的菌剂；
18.物质ⅲ为上述的施氏假单胞菌的发酵液。
19.物质ⅰ和/或物质ⅱ和/或物质ⅲ作为srb抑制剂在油井采出液处理中的应用；
20.物质ⅰ为上述的施氏假单胞菌；
21.物质ⅱ为上述的菌剂；
22.物质ⅲ为上述的施氏假单胞菌的发酵液。
23.一种产品，其活性成分为物质ⅰ和/或物质ⅱ和/或物质ⅲ；
24.物质ⅰ为上述的施氏假单胞菌；
25.物质ⅱ为上述的菌剂；
26.物质ⅲ为上述的施氏假单胞菌的发酵液；
27.所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)；
28.(a)油田含油污水处理；
29.(b)油井采出液处理；
30.(c)srb抑制剂。
31.一种在油井采出液中抑制硫酸盐还原菌的方法，通过连续投加的方式向油井注入液中加入物质ⅰ和/或物质ⅱ和/或物质ⅲ；
32.物质ⅰ为上述的施氏假单胞菌；
33.物质ⅱ为上述的菌剂；
34.物质ⅲ为上述的施氏假单胞菌的发酵液。
35.有益效果：本发明的优点和有益效果在于：
36.1、本发明提供的一株施氏假单胞菌dn-1生长温度为30～60℃，能够在油藏条件下原位生长，微生物菌剂能够有效抑制srb的滋生，减少油井的腐蚀(因硫酸盐还原菌产生硫化氢所导致的腐蚀)，使用后腐蚀速率由0.094mm/a降低至0.025mm/a；
37.2、微生物菌剂使用方便且效果好，经济效益高，同时可避免传统化学杀菌剂的使用所带来的用量大、成本高和安全环保性能差等问题。
附图说明
38.图1为本发明公开的施氏假单胞菌dn-1菌株的形态图。
39.图2为本发明公开的施氏假单胞菌dn-1的系统发育树。
40.图3为本发明公开的施氏假单胞菌dn-1在胜利油田纯梁采油厂某两口油井应用前后腐蚀速率的变化情况。
具体实施方式：
41.下面对本发明的具体实施方式详细说明。
42.实施例1：
43.施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1菌株的筛选。
44.取纯梁采油厂srb滋生严重的油井采出液，用一次性注射器取1ml，接入培养基(培养基组成：葡萄糖2g/l，甲醇2g/l，乙酸钠2g/l，硝酸钠1g/l，磷酸二氢钾2g/l，酵母粉0.5g/l，氯化钠5g/l，ph值为7)，配制培养基过程中全程采用80％氮气吹脱以保证厌氧环境)，50℃恒温培养7d至培养基上出现单菌落为止。挑取培养基上的单菌落转入相同成分的厌氧液体培养基进行扩大培养，50℃恒温培养7d。取培养液再次接入厌氧固体培养基，50℃恒温培养7d，分离出单菌落。
45.将生长良好的各个单菌落，分别接种到相同成分的厌氧液体培养基中，50℃恒温培养3d，之后通过检测培养基中硝酸盐含量的降低情况来筛选反硝化能力强的菌株，最终得到一株反硝化效果最好的菌株，命名为菌株dn-1。
46.实施例2：
47.施氏假单胞菌dn-1的鉴定与保藏
48.一、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1的形态和生理生化特征。
49.1、供试菌株
50.本发明实施例1所分离的菌株dn-1。
51.2、实验方法
52.参照《bergey’smannual of systematic bacteriology》的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，生长温度，生长ph范围，nacl耐受性。进行甲基红、接触酶、v-p、葡萄糖产酸、淀粉水解、脓青素、氧化酶实验，硝酸盐还原、亚硝酸盐还原实验，以及利用乙酸盐、柠檬酸盐、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、肌糖、乳糖、鼠李糖和蔗糖实验。
53.3、实验结果
54.结果表明：
55.1、菌株dn-1的形态学特征：
56.(1)菌落特征：菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，湿润。
57.(2)细胞形态特征：细胞呈杆状，有单端鞭毛，大小为(0.2～0.4)
×
(4～20)μm，如图1所述。
58.2、菌株dn-1的生理生化特性：兼性厌氧，生长温度30～60℃，最适生长温度50℃，生长ph范围5～10，最佳生长ph范围7～8，nacl的耐受性0～15％。
59.3、接触酶实验为阳性，甲基红、v-p、利用葡萄糖产酸、水解淀粉、脓青素、氧化酶实验皆为阴性。能够还原硝酸盐和亚硝酸盐，能利用乙酸盐、柠檬酸盐、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖和蔗糖，不能利用木糖和肌糖。
60.菌株dn-1的部分生理生化特征如表1所示：
61.表1 菌株dn-1的部分生理生化特征
[0062][0063][0064]
4、综合菌株的形态特征、生理生化特征、16s rrna和基因组序列分析结果，菌株dn-1属于施氏假单胞菌属的一个新种，具体为pseudomonas stutzeri。
[0065]
二、施氏假单胞菌dn-1的保藏
[0066]
本发明提供的一株施氏假单胞菌dn-1菌株，以下简称dn-1，于2021年07月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为“cgmcc no.22969”，分类命名中文名称为“施氏假单胞菌”，拉丁文名称为“pseudomonas stutzeri”。
[0067]
实施例3：
[0068]
施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1对硫酸盐还原菌的抑制能力实验。
[0069]
1、供试菌株
[0070]
本发明实施例1所分离的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1菌株。
[0071]
2、实验方法
[0072]
将供试菌株挑取单菌落接入100ml厌氧液体培养基中37℃过夜培养至对数生长期，培养基成分与实施例1中相同。取含有不同数量硫酸盐还原菌(srb)的油井采出液4份分别装于100ml厌氧瓶中，mpn法测定srb的数量分别为25个/ml，600个/ml，2500个/ml，6000个/ml，将培养好的菌液以2％的接种量接种至4个厌氧瓶中，放置于37℃恒温箱中，24h后检
测srb数量。
[0073]
3、试验结果
[0074]
试验结果如表2所示。在37℃条件下，初始硫酸盐还原菌数量(25～6000)个/ml，在接种该菌液24h后，硫酸盐还原菌数量减少到(2.5～250)个/ml，该菌对硫酸盐还原菌有明显的抑制作用。
[0075]
表2 施氏假单胞菌dn-1接种前后硫酸盐还原菌数量对比
[0076]
样品序号接种前(个/ml)接种后(个/ml)1252.5260025325006046000250
[0077]
实施例4：
[0078]
施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1在胜利油田纯梁采油厂某区块的两口油井a-21、a-35的应用
[0079]
1、供试菌株
[0080]
本发明实施例1所分离的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1菌株。
[0081]
2、配置菌液
[0082]
将施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1挑取单菌落接入100ml厌氧液体培养基中，37℃过夜培养至对数生长期，得到菌液，其中：
[0083]
厌氧液体培养基为：葡萄糖1g/l，甲醇1.5g/l，乙酸钠0.5g/l，硝酸钠0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，酵母粉0.2g/l，氯化钠3g/l，ph值为7。
[0084]
3、油井概况
[0085]
胜利油田纯梁采油厂两口油井(a-21、a-35)srb含量高，腐蚀速率高，平均腐蚀速率达到0.094mm/a，前期投加杀菌剂十二烷基二甲基苄基氯化铵，投加浓度150mg/l，cl-21、cl-35油井处理后菌浓分别为1000个/ml和2500个/ml，杀菌率分别为60％和58.4％，腐蚀速率分别为0.052mm/a和0.050mm/a，杀菌和防腐效果不理性，未投加施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1前采出液水质如表3所示。
[0086]
表3 两口油井采出液水质分析结果
[0087][0088][0089]
3、实施步骤
[0090]
通过油井加药机进行持续滴加菌液的方式进行投加，利用菌液与采出液充分接触反应，按投加浓度150mg/l将施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1菌液投加到加药机中，投加方式为连续投加。
[0091]
4、试验结果
[0092]
在井口每隔5天检测srb及腐蚀速率，srb的数量最终由2500个/ml、6000个/ml降为60个/ml、个/ml，最终两口油井的腐蚀速率控制在0.025mm/a以下，防腐率降低幅度达到73％以上，杀菌率达到95％以上，杀菌和防腐效果明显。
[0093]
实施例5
[0094]
施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1在胜利油田纯梁采油厂某区块两口油井b-45、b-52的应用。
[0095]
1、供试菌株
[0096]
本发明实施例1所分离的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1菌株。
[0097]
2、配置菌液
[0098]
将施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1挑取单菌落接入100ml厌氧液体培养基中，37℃过夜培养至对数生长期，得到菌液，其中：
[0099]
厌氧液体培养基为：葡萄糖8g/l，甲醇3.0g/l，乙酸钠2.5g/l，硝酸钠2.0g/l，磷酸二氢钾3g/l，酵母粉0.8g/l，氯化钠8g/l，ph值为8。
[0100]
3、油井概况
[0101]
胜利油田纯梁采油厂两口油井(b-45、b-52)srb含量高，腐蚀速率高，平均腐蚀速率达到0.081mm/a，前期投加杀菌剂十二烷基二甲基苄基氯化铵，投加浓度120mg/l，b-45、b-52油井处理后菌浓分别为500个/ml和1500个/ml，杀菌率分别为75％和70％，腐蚀速率分别为0.050mm/a和0.047mm/a，杀菌和防腐效果不理性，未投加施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1前采出液水质如表4所示。
[0102]
表4 两口油井采出液水质分析结果
[0103][0104]
3、实施步骤
[0105]
通过油井加药机进行持续滴加菌液的方式进行投加，利用菌液与采出液充分接触反应，按投加浓度120mg/l将施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)dn-1菌液投加到加药机中，投加方式为连续投加。
[0106]
4、试验结果
[0107]
在井口每隔5天检测srb及腐蚀速率，srb的数量由2000个/ml、5000个/ml降为50个/ml、100个/ml，最终两口油井b-45、b-52的腐蚀速率分别为0.020mm/a和0.018mm/a，防腐
率降低幅度达到70％以上，杀菌率达到97％以上，杀菌和防腐效果明显。
[0108]
实施例6
[0109]
与实施例5大致相同，区别仅仅在于厌氧液体培养基不同：
[0110]
厌氧液体培养基为葡萄糖2g/l，甲醇2g/l，乙酸钠1.5g/l，硝酸钠0.8g/l，磷酸二氢钾1.2g/l，酵母粉0.3g/l，氯化钠3g/l，ph值为7.5。
[0111]
实施例7
[0112]
与实施例5大致相同，区别仅仅在于厌氧液体培养基不同：
[0113]
厌氧液体培养基为葡萄糖5g/l，甲醇2.5g/l，乙酸钠2.0g/l，硝酸钠1.5g/l，磷酸二氢钾2.0g/l，酵母粉0.5g/l，氯化钠5g/l，ph值为8。
[0114]
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。