用于食管癌诊断的生物标志物及其应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及用于食管癌诊断的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.近十几年来恶性肿瘤的发病率有所增加，其中60％以上为消化系统的恶性肿瘤。食管癌是我国常见恶性肿瘤之一。食管癌的发生与长期进食含亚硝胺类物质、周围环境、地域分布、遗传因素以及膳食结构中维生素及微量元素缺乏有关。随着医疗水平的提高，食管癌的诊断与治疗方面新技术、新方法层出不穷，但统计发现食管癌的死亡率并没有明显下降。其原因在于半数以上的患者在首次就诊时已属于中晚期。
3.随着分子生物学技术的不断发展，人们开始关注与肿瘤相关的生物标志物的研究。它是反映疾病存在的一类物质，它们的存在或量变可提示疾病的存在。从上个世纪60年代开始生物标志物己广泛应用于临床。生物标志物检测具有简便、经济、快速的特点，一些生物标志物在组织器官发生形态学变化之前就有表达，且伴随疾病发生发展到终结的全过程，所以备受临床医生的关注。目前生物标志物的种类己达百余种，但至今尚未发现一种理想的生物标志物可单独应用于临床作为食管癌诊断。因此，寻找特异敏感的生物标志物已成为目前临床和基础研究的重要方向。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于建立用于食管癌诊断的高灵敏度、高稳定性的方法，所述的方法包括检测样本中hsa_circ_0060927表达水平。
5.第一方面，本发明提供了检测样本circrna表达水平的试剂在制备诊断食管癌的工具中的应用，所述的circrna包括hsa_circ_0060927。
6.在本发明中，hsa_circ_0060927位于人1号染色体上，包括hsa_circ_0060927基因及其同源物，突变，和同等型。在基因组上的定位为chr20:52773707
‑
52788209。
7.术语“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码和/或表观遗传信息)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mrna)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成rna但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体rna)，作为本发明的一种优选的方案，所述“表达”指转录的多核苷酸。
[0008]“增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。
[0009]“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。
[0010]
在一些实施方案中，所述的食管癌包括食管鳞癌、食管腺癌，优选为食管鳞癌。
[0011]
在一些实施方案中，所述的检测样本circrna表达水平的试剂包括采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circrna表达水平的试剂。
[0012]
在一些实施方案中，所述的检测样本circrna表达水平的试剂包括采用高通量测序技术、探针杂交技术、荧光原位杂交技术、基因芯片技术或荧光定量pcr技术检测样本circrna表达水平的试剂。
[0013]
通过高通量测序能获知待检测样本中hsa_circ_0060927的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容易判断待测样本是否患有食管癌以及患食管癌的风险。因此，通过高通量测序获得hsa_circ_0060927表达水平与食管癌相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。
[0014]
在一些实施方案中，所述的试剂为采用荧光原位杂交技术检测样本circrna表达水平的试剂。
[0015]
在一些实施方案中，所述的采用荧光原位杂交技术检测样本circrna表达水平通过统计细胞中的荧光信号判断circrna表达水平来实现。
[0016]
在一些实施方案中，所述的统计细胞中的荧光信号判断circrna表达水平的方法包括计算ratio值，所述的ratio值为100个细胞核中circrna荧光信号总数与100个细胞核中dapi荧光信号总数的比值。作为一种优选的实施方式，若样本中所述ratio值＜2，判断该样本中所述circrna低表达，若样本中所述ratio值>2，判断该样本中所述circrna高表达。
[0017]
在一些实施方案中，所述的统计细胞中的荧光信号判断circrna表达水平的方法包括对细胞中的荧光信号进行计数，若样本中>10％的细胞中存在≥15个circrna荧光信号或存在成簇的circrna荧光信号的，或>40％的细胞中存在≥4个circrna荧光信号，判断该样本中所述circrna高表达。
[0018]
本文中使用的“样本”可以是细胞或组织样本(例如活检物)、生物流体、提取物(例如从对象获得的蛋白质或dna提取物)。特别地，样本可以是肿瘤样本，例如实体瘤，例如食管癌。样本可以是从对象新鲜获得的样本，或者可以是在进行确定之前已经加工和/或储存的样本(例如，冷冻、固定或经历一个或更多个纯化、富集或提取步骤)。本发明中所述的样本包括但不限于血液、玻璃体液、淋巴液、滑液、精液、羊水、乳、尿液、脑脊髓液、唾液、痰、泪、汗液、粘液、组织、粪便，优选为组织。
[0019]
在一些实施方案中，hsa_circ_0060927在食管癌样本中表达上调。
[0020]
在一些实施方案中，所述的试剂包括引物、探针或其组合。
[0021]
本文所使用的术语“引物”是指具有短游离3'
‑
羟基的核酸序列，是可以与互补模板形成碱基对并充当模板链复制的起点的短核酸。在适当的缓冲溶液和温度下，在存在用于聚合的试剂(即dna聚合酶或逆转录酶)和四种不同的核苷三磷酸的情况下，引物可以引发dna合成。可以根据本领域已知的技术适当地选择pcr条件以及正义和反义引物的长度。
[0022]
本文所使用的术语“探针”是指对应于可以特异性结合mrna的几个碱基至数百个碱基的核酸片段(例如rna或dna)，并且可以通过标签来确认特定mrna的存在与否以及表达水平。探针可以以寡核苷酸探针、单链dna探针、双链dna探针或rna探针的形式制备。可以根据本领域已知的技术适当地选择合适的探针和杂交条件。
[0023]
在一些实施方案中，所述的试剂为探针，作为一种优选的实施方式，所述的探针的序列如seq id no.1所示。
[0024]
第二方面，本发明提供了一种诊断食管癌的工具，所述的工具包括检测检测样本circrna表达水平的试剂，所述的circrna包括hsa_circ_0060927。
[0025]
在一些实施方案中，所述的工具包括试剂盒、芯片或核酸膜条。
[0026]
本发明提供的试剂盒包括检测hsa_circ_0060927的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
[0027]
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
[0028]
在本发明中，试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
[0029]
本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于hsa_circ_0060927所示的部分或全部序列。
[0030]
本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
[0031]
所述的hsa_circ_0060927芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的circrna芯片。
[0032]
在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别hsa_circ_0060927寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
[0033]
本发明中试剂盒或芯片或核酸膜条可用于检测包括hsa_circ_0060927基因在内的多个基因(例如，与食管癌相关的多个基因)的表达水平，将食管癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管癌诊断的准确率。
[0034]
在一些实施方案中，所述的食管癌包括食管鳞癌、食管腺癌，优选为食管鳞癌。
[0035]
第三方面，本发明提供了一种预测食管癌的装置，所述装置包括：
[0036]
处理器；
[0037]
输入模块，用于输入生物样品中circrna的表达水平，所述的circrna包括hsa_circ_0060927。
[0038]
包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在生物标志物的输入水平上执行算法；以及
[0039]
输出模块，指示受试者是否患有食管癌或者存在患食管癌的风险。
[0040]
如本文应用的装置应至少包括上述模块。装置的模块可操作地彼此连接。如何以操作方式链接将取决于装置中包含的模块的类型。
[0041]
所述处理器可以执行一系列的机器可读指令，该机器可读指令可以以程序或软件来体现。指令可以被存储于存储器位置，诸如存储器中。指令可以被导向处理器，该指令可以随后编程或以其他方式配置处理器以实现本公开内容。由处理器进行的操作的实例可以包括读取、解码、执行和写回。
[0042]
所述的计算机可读存储介质存储有程序，所述程序用于执行由hsa_circ_0060927构建的食管癌预测模型。所述计算机可读存储介质诸如计算机可执行代码，可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如光盘或磁盘，诸如在任何计算机等中的任何存储设备，易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形的传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频和红外数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软性磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、cd
‑
rom、dvd或dvd
‑
rom、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔模式的任何其他物理存储介质、ram、rom、prom和eprom、flash
‑
eprom、任何其他存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输此类载波的缆线或链路，或者计算机可以从其读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质的形式中的许多形式可以参与向处理器传送一个或更多个指令的一个或更多个序列以用于执行。
[0043]
在一些实施方案中，所述的食管癌包括食管鳞癌、食管腺癌，优选为食管鳞癌。
[0044]
第四方面，本发明提供了circrna在构建预测食管癌的计算模型中的应用，所述的circrna包括hsa_circ_0060927。
[0045]
在一些实施方案中，所述的食管癌包括食管鳞癌、食管腺癌，优选为食管鳞癌。
附图说明
[0046]
图1为利用荧光原位杂交检测hsa_circ_0060927的表达的实验结果图；
[0047]
图2为114例食管癌组织及66例正常组织中hsa_circ_0060927表达的统计图，图中***表示p＜0.001；
[0048]
图3为hsa_circ_0060927诊断食管癌的roc曲线图。
具体实施方式
[0049]
以下结合附图对本技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本技术，并不用于限制本技术。
[0050]
实施例1基因差异表达
[0051]
一、实验材料与方法
[0052]
1.主要实验设备、仪器
[0053]
表1实验设备、仪器
[0054]
设备、仪器来源组织切片机(rm2135型)德国leica公司摊片烤片机(cs
‑
vi型)孝感宏业医用仪器有限公司数显电热保温箱(303
‑
4a型)上海阳光实验仪器有限公司scilogex掌上离心机(d1008型)北京科博塞尔生物科技公司激光共聚焦显微镜(lsm900)德国zeiss公司图像采集系统(qcapture)加拿大qimaging公司快速混匀器(xk96
‑
a型)江苏新康医疗器械有限公司eppendorfresearch移液器德国eppendorf公司电子天平(pb3002
‑
s)瑞士mettler公司
[0055]
2.组织芯片制备
[0056]
组织芯片(hesos180su08)由生物芯片上海国家工程研究中心制备。114例食管癌患者均为首次发病，且术前未行放疗、化疗和内分泌治疗。病理分型均为食管鳞状细胞癌，其中包括114例食管癌组织及66例正常食管组织。114例食管癌标本中，按照性别分组，男性84人(73.68％)，女性30人(26.32％)；按照年龄分组，＜60岁33人(28.95％)，≥60岁81人(71.05％)；按照美国癌症联合委员会(ajcc)第7版临床分期，
ⅰ‑ⅱ
期58例(56.67％)，
ⅲ‑ⅳ
期56例(43.33％)；按照组织学分组，ⅰ级47例(41.23％)，
ⅱ‑ⅲ
级67例(58.77％)；按照有无淋巴转移分组，有淋巴结转移61例(53.51％)，无淋巴结转移53例(46.49％)；按照t分期分组，t1‑2者27例(23.68％)，t3‑4者87例(76.32％)。所有组织蜡块常规病理切片后行he染色，并在切片上根据典型病理部位作标记。利用组织芯片制作仪在受体蜡块打孔(直径1.5mm)，然后根据标记好的典型病理部位获取相应组织芯片放入受体蜡块列阵孔中，并记录组织编号。利用切片机(leica德国)以4um厚度进行连续切片以制备成组织芯片切片，每个点均再次经过he染色以进行病理诊断。
[0057]
3.利用荧光原位杂交(fish)检测hsa_circ_0060927的表达
[0058]
将4um石蜡切片放置在预先处理好的载玻片上。切片50℃烤过夜，然后进行二甲苯脱蜡和水化，以及梯度酒精。去离子水5min，蛋白酶k孵育切片10min后加入杂交液封闭60min。之后与hsa_circ_0060927探针(探针序列如seq id no.1所示，具体为5
’‑
tcttccccttccctgaggcgtatta
‑3’
)37℃杂交过夜。用4
×
ssc、2
×
ssc、1
×
ssc及pbs洗涤切片，滴加cy5荧光染料避光孵育60min,pbs清洗后dapi复染，最后在激光共聚焦显微镜下判读。结果判读标准：计数至少100个细胞，统计ratio值。ratio值＝100个细胞核中红信号总数/100个细胞核中蓝信号总数。若ratio<2为阴性结果，提示该样本hsa_circ_0060927低表达；若ratio>2为阳性结果，提示该样本hsa_circ_0060927高表达；此外，若>10％的细胞中存在≥15个红色信号或存在成簇的红色信号的，或>40％的细胞中存在≥4个红色信号，均为阳性结果，提示样本hsa_circ_0060927高表达。以上红色信号(hsa_circ_0060927)和蓝色信号(dapi)均由两名病理医生和技术人员手动计数。
[0059]
二、实验结果
[0060]
如图1、图2、表2所示，与正常对照相比，hsa_circ_0060927在食管癌中表达上调。
[0061]
表2 hsa_circ_0060927在食管癌中的表达情况
[0062]
基因c_readcountn_readcountlog2foldchangepvalpadj
hsa_circ_0060927300.7195.2125.8450.0000.000
[0063]
实施例2诊断效能分析
[0064]
一、实验方法
[0065]
将fish检测hsa_circ_0060927的表达结果进行分析和评分。操作者工作特征roc(receiver operating characteristic)曲线和曲线下面积(auc值)来衡量模型的区分度，auc值越接近1，说明模型的区分度越好。打开spss，导入分组及评分结果，点击“analyze
‑
roc curve”，弹出界面后，导入a2列数据(评分结果)，确认后出现roc曲线。以患者hsa_circ_0060927的表达水平作为自变量，并以可获取最大youden指[(特异度+灵敏度)
‑
1]作为cut off值，计算和分析hsa_circ_0060927单独应用的诊断效能。
[0066]
二、实验结果
[0067]
如图3、表3所示，hsa_circ_0060927具有较好的诊断效能。
[0068]
表3 hsa_circ_0060927诊断效能
[0069]
基因auc特异度敏感度hsa_circ_00609270.8580.9910.697
[0070]
以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。