一种低色度高多糖含量灵芝提取物及其制备方法与流程

1.本发明属于食品与化妆品原料制备技术领域，具体涉及一种低色度高多糖含量灵芝提取物及其制备方法。


背景技术：

2.随着公众安全意识的提高，许多以天然成分为基础的食品、保健食品、化妆品市场发展迅速。这些天然成分具有毒性小，副作用少等明显优势。因而，以药用植物和药用真菌为原料提取的天然活性成分成为了食品、保健食品与化妆品原料的重要来源之一。
3.灵芝是一种世界著名的药食两用真菌，在中国传统医学中已经使用了数千年。据报道，它含有400多种不同的生物活性化合物，其中灵芝主要的天然活性成分之一灵芝多糖具有多种潜在作用，包括调节免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖和抗氧化等功能。以灵芝为来源的提取物已广泛用于食品、保健食品以及化妆品的开发。
4.目前已经报道多种灵芝提取物的制备方法，但生产上灵芝提取物制备普遍采用水提及筛网过滤，去除残渣。该方法制备的灵芝提取物复溶后，易产生大量不可溶性物质，难以直接应用于对澄清度要求高的产品开发。例如，专利cn 110447889 a公开了一种灵芝提取物的制备方法，以灵芝子实体为原料，水提，蝶式离心机去渣，浓缩后采用过滤精度为5
‑
15μm过滤器粗滤，制得灵芝提取物。该方法采用蝶式离心去渣方式，难以去除微小不溶颗粒，后期采用过滤精度5
‑
15μm过滤器亦难去除这些难溶性颗粒。专利cn 111467378 a公开了一种灵芝提取物粉末的生产工艺及其生产线，采用水提，过滤机粗过滤，干燥，制成灵芝提取物，最后粉碎过80目筛，制成灵芝提取物粉末。由于该法采用粗过滤方式，制成的灵芝提取物粉末复溶后亦存在大量不溶物。此外，由于灵芝中蕴含大量色素，且极易溶于水。传统水提法制备的灵芝提取物颜色极深，微量添加虽然色度较低，但灵芝活性物质浓度也同时降低，亦失去灵芝特有的功效。因而采用水提及粗过滤方式制备的灵芝提取物难以直接应用于制备低色度及高澄清度液体类产品。
5.为了更为广泛的应用灵芝有效成分，人们开发出多种灵芝多糖脱色方法。比如：专利cn 105017441 a公开了一种灵芝多糖的提取方法，采用乙醇脱脂、滤渣水提、浓缩、醇沉、离心，乙醇和丙酮分别洗涤沉淀，蒸馏水复溶，超滤膜截留大于50kd多糖截留液，浓缩，再用超滤膜收集小于80kd的多糖透过液，再离心，过滤，活性碳脱色，过滤，喷雾干燥。虽然该方法制备的多糖色泽洁白，但步骤极其繁琐，且引入有机溶剂，多糖得率低，同时丢失了大量其他活性成分，难以规模化生产。专利cn 107698690 a公开了一种灵芝多糖溶液的脱色方法，利用弱碱阴离子交换树脂吸附多糖，乙醇洗柱，再用盐酸与氢氧化钠溶液交替解析吸附于树脂上的多糖，并调解析液ph至中性，浓缩，干燥，制成脱色灵芝多糖。该方法采用离子交换树脂脱色，脱色效果较好，但采用酸碱洗脱方式，导致制备的多糖含较多盐分，同时该制备过程亦丢失了大量灵芝活性物质。专利cn 1944465 a公开了一种灵芝孢子多糖的精制工艺，采用脱脂、水提、静置、过滤、浓缩、醇沉、醇洗、干燥、复溶、离心、h2o2脱色、sevag脱蛋白、醇沉、醇洗、丙酮洗、干燥等步骤。该方法虽可制取高纯度多糖，但步骤繁琐，引入有机溶剂，
难以规模化生产。以上这些方法制备的灵芝多糖纯度较高，但多糖脱色的过程，不仅引入了有机溶剂以及盐分等物质，同时也大量丢失了三萜、麦角甾醇、活性肽、氨基酸和生物碱等灵芝活性物质。
6.鉴于上述，现有生产上制备的灵芝提取物存在色度高、不可溶性颗粒物多以及灵芝多糖制备工艺难以有效保留灵芝三萜、麦角甾醇、活性肽、氨基酸和生物碱等缺点。因而，急需开发出一种不仅可以有效保留灵芝活性物质，而且可快速、规模化制备，广泛用于各类普通食品、保健食品以及化妆品研究和开发的脱色灵芝提取物。


技术实现要素：

7.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种低色度高多糖含量灵芝提取物的制备方法。该方法操作简单，可有效保留灵芝活性物质，无需引入有机溶剂以及后续脱盐等操作，适用于大规模生产低色度灵芝提取物。
8.本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的低色度高多糖含量灵芝提取物。该灵芝提取物可广泛用于各类普通食品、保健食品以及化妆品，具有低色度、高澄清度、应用广、功效好的优点。
9.本发明目的通过以下技术方案实现：
10.一种低色度高多糖含量灵芝提取物的制备方法，包括如下制备步骤：
11.(1)热水动态提取：取灵芝子实体置于提取罐中，加入纯水混合后加热搅拌提取，过滤收集灵芝水提物；
12.(2)蝶式离心：将步骤(1)所得灵芝水提物使用蝶式离心机进行二次去渣，收集滤液；
13.(3)精滤：将步骤(2)所得滤液采用孔径为200～1200nm的微滤膜精滤，去除残渣，收集透过液，浓缩，得到浓缩液；
14.(4)将步骤(3)所得浓缩液使用大孔吸附树脂进行动态脱色，收集脱色液，随后用纯水清洗，收集清洗液，合并脱色液和清洗液；
15.(5)将步骤(4)所得合并液经浓缩，干燥，得到低色度高多糖含量灵芝提取物。
16.进一步地，步骤(1)中所述灵芝子实体与纯水混合的料液比为1:15～1:45。
17.进一步地，步骤(1)中所述加热搅拌提取的温度为65～100℃，搅拌转速为90～180rpm，提取时间为0.5～3h。
18.进一步地，步骤(1)中过滤后的固相经多次提取，合并提取液。
19.进一步地，步骤(3)中所述微滤膜的孔径优选为400～1000nm。
20.进一步地，步骤(3)中所述浓缩采用真空浓缩或反渗透进行浓缩，使浓缩液中固体含量为80～300g/l。更优选浓缩液中固体含量为100～150g/l。
21.进一步地，步骤(4)中所述大孔吸附树脂采用hpd
‑
100或nka
‑
9大孔吸附树脂。
22.进一步地，步骤(4)中所述动态脱色按浓缩液与树脂填料体积等于0.5:1～5:1进行上柱脱色；优选浓缩液与树脂填料体积等于2:1进行上柱脱色。
23.进一步地，步骤(4)中所述纯水清洗采用1～10倍填料体积的纯水清洗；优选采用4倍填料体积的纯水清洗。
24.进一步地，步骤(5)中所述浓缩采用真空浓缩或反渗透进行浓缩，使浓缩液中固体
含量为80～200g/l。
25.进一步地，步骤(5)中所述干燥是指真空干燥或喷雾干燥。
26.进一步地，上述方法制备得到的低色度高多糖含量灵芝提取物的固体回收率为80～93％，灵芝多糖含量为10～14％，灵芝多糖的回收率为75～86％。(本发明固体回收率是指制得的脱色后灵芝提取物总重占脱色前灵芝提取物总重的百分比，灵芝多糖回收率是指制得的脱色后灵芝提取物多糖总量占脱色前灵芝提取物多糖总量的百分比)。
27.一种低色度高多糖含量灵芝提取物，通过上述方法制备得到。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
29.(1)本发明的制备方法采用热水动态提取工艺，结合离心及微滤膜精滤，不仅提高活性物质提取率，而且有效降低了灵芝提取物中的微小不溶物，减少对后续各类产品开发的干扰。
30.(2)本发明方法采用大孔吸附树脂(非离子型树脂)对灵芝提取物进行动态脱色，无需引入有机溶剂以及酸碱洗脱，减少后续除杂操作。
31.(3)相比于现有的灵芝多糖脱色方法，本方法不仅能有效保留多种灵芝活性成分，而且操作简单、适合规模化生产。
附图说明
32.图1是实施例1中葡萄糖标准曲线图；
33.图2是实施例3中步骤(2)脱色前赤芝提取物与步骤(4)脱色后赤芝提取物的色度对比图；
34.图3是实施例3中步骤(2)脱色前赤芝提取物与步骤(4)脱色后赤芝提取物的多糖含量图；
35.图4是实施例4中步骤(2)脱色前白肉灵芝提取物与步骤(4)脱色后白肉灵芝提取物的色度对比图；
36.图5是实施例4中步骤(2)脱色前白肉灵芝提取物与步骤(4)脱色后白肉灵芝提取物的多糖含量图；
37.图6是实施例5中测试所得脱色的赤芝提取物和脱色白肉灵芝提取物对dpph自由基清除能力对比图；
38.图7是实施例6中测试所得脱色的赤芝提取物和脱色白肉灵芝提取物对abts自由基清除能力对比图；
39.图8是实施例7中测试所得脱色的赤芝提取物和脱色白肉灵芝提取物对酪氨酸酶活性抑制能力对比图。
具体实施方式
40.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
41.实施例1
42.本实施例为葡萄糖标准曲线的制作：
43.(1)准确称取分析纯葡萄糖50mg(105℃干燥至恒重)，用蒸馏水溶解定容至500ml，
得到100μg/ml的葡萄糖标准溶液。
44.(2)分别吸取上述葡萄糖标准溶液0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml于6支比色管内，依次加入1.00ml、0.80ml、0.60ml、0.40ml、0.20ml、0.00ml纯水。
45.(3)往上述试管中均加入1.5ml 5％苯酚溶液和7.0ml浓硫酸，摇匀，反应半小时。待冷却后，于488nm下，使用分光光度计检测od
488
值。
46.(4)按浓度与吸光值的比绘制葡萄糖标准曲线，结果如图1所示。
47.实施例2
48.本实施例为灵芝提取物多糖含量的测定方法：
49.(1)准确配制固体含量为1％的灵芝提取物溶液。
50.(2)多糖醇沉：取5m上述1％灵芝提取物溶液，加入25ml无水乙醇，振荡均匀后沉淀过夜。
51.(3)将步骤(2)中的多糖醇沉液4000rpm离心15min，弃去上清液，取沉淀物，再加无水乙醇30ml，反复操作二次，沉淀物用去离子水溶解定容于100ml(也可视沉淀物的量而定)，制得多糖溶液。
52.(4)吸取1ml上述多糖溶液于10ml比色管，加苯酚1.5ml和浓硫酸7.0ml摇匀，反应半小时。待冷却后，于488nm下，使用分光光度计检测od
488
值。
53.(5)利用实施例1所得葡萄糖标准曲线计算灵芝提取物总多糖含量。
54.实施例3
55.本实施例为一种低色度高多糖含量赤芝提取物的制备：
56.(1)取20公斤经粉碎后的赤芝(ganoderma lucidum)子实体，按料液比等于1:20加入纯水，制成灵芝子实体悬液。将上述悬液加热至90℃，90rpm搅拌提取60min，使用200目筛网过滤；残渣使用15倍水重复提取一次，使用200目筛子过滤，合并提取液获得640l赤芝提取液。
57.(2)将步骤(1)中经筛网粗滤后的赤芝提取液使用蝶式离心机进行二次去渣，收集滤液。
58.(3)将步骤(2)的滤液用800nm微滤膜精滤，收集透过液，随后将透过液用真空浓缩至固体物质含量约为100g/l的赤芝水提浓缩液。
59.(4)将上述赤芝水提浓缩液与nak
‑
9树脂填料体积比等于2:1进行上样，待浓缩液完全透过填料后，再加入4倍填料体积的纯水，清洗残留于树脂空隙中的赤芝多糖等活性物质，收集以上全部透过树脂的液体，即得赤芝水提脱色液。
60.(5)将上述赤芝水提脱色液进行真空浓缩至固体含量为150g/l的赤芝水提脱色浓缩液，然后进行喷雾干燥，制得低色度高多糖含量赤芝提取物。
61.本实施例所得赤芝提取物经测定多糖含量为13.8％，固体回收率为93％，多糖回收率为86％。
62.本实施例步骤(2)脱色前赤芝提取物(1％含量)与步骤(4)脱色后赤芝提取物(分别为0.2％、0.5％、1％含量)的色度对比图如图2所示。脱色前赤芝提取物和脱色后赤芝提取物多糖含量图如图3所示。
63.实施例4
64.本实施例为一种低色度高多糖含量脱色白肉灵芝提取物制备：
65.(1)取20公斤经粉碎后的白肉灵芝(ganoderma leucocontextum)子实体，按料液比等于1:15加入纯水，制成白肉灵芝子实体悬液。将上述悬液加热至80℃，120rpm搅拌提取60min，使用200目筛网过滤，残渣使用15倍水重复提取一次，使用200目筛子过滤，合并提取液获得500l白肉灵芝提取液。
66.(2)将步骤(1)中经筛网粗滤后的白肉灵芝提取液使用蝶式离心机进行二次去渣，收集滤液。
67.(3)将步骤(2)的滤液用500nm微滤膜精滤，收集透过液，随后将透过液用真空浓缩至固体物质含量约为150g/l的白肉灵芝水提浓缩液。
68.(4)将上述白肉灵芝水提浓缩液与hpd
‑
100树脂填料体积比等于1.5:1进行上样，待浓缩液完全透过填料后，再加入4倍填料体积的纯水，清洗残留于树脂空隙中的白肉灵芝多糖等活性物质，收集以上全部透过树脂的液体，即白肉水提脱色液。
69.(5)将上述白肉水提脱色液进行真空浓缩至固体含量为200g/l的浓缩液，然后进行喷雾干燥，制得低色度高多糖含量脱色白肉灵芝提取物。
70.本实施例所得白肉灵芝提取物经测定其中多糖含量为12.3％，固体回收率为90％，多糖回收率为78％。
71.本实施例步骤(2)脱色前白肉灵芝提取物(1％含量)与步骤(4)脱色后白肉灵芝提取物(分别为0.2％、0.5％、1％含量)的色度对比图如图4所示。脱色前白肉灵芝提取物和脱色后白肉灵芝提取物多糖含量图如图5所示。
72.实施例5
73.本实施例对所得灵芝提取物的dpph自由基清除活性进行检测：
74.(1)准确称取0.0197g dpph，用无水乙醇溶解并定容至250ml，即得0.2mmol/l dpph工作液。
75.(2)取一定量脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物用蒸馏水分别配置成浓度为0、0.1％、0.2％和0.5％的脱色的赤芝提取物或白肉提取物溶液。
76.(3)分别吸取50μl上述不同浓度的脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液置于96孔板中，再加入150μl dpph溶液，每组三个平行。室温避光反应1小时，反应完成后，用酶标仪测517nm吸光度值。
77.(4)所测的od值按以下公式计算：
[0078][0079]
式中d
对照
为不加脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液的dpph溶液od值，d
空白
为脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液自身od值，d
样品
为脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液与dpph溶液反应后的od值。
[0080]
测试结果如图6所示。由图6结果可见，本发明脱色的赤芝提取物和白肉灵芝提取物均具有显著的dpph自由基清除能力。
[0081]
实施例6
[0082]
本实施例对所得灵芝提取物的abts自由基清除活性进行检测：
[0083]
(1)配制200ml 0.2mol/l磷酸盐缓冲液(pbs，酸碱值7.4)。
[0084]
(2)取17.57mg过硫酸钾溶于蒸馏水中，定容至25ml，制成2.6mm过硫酸钾溶液。
[0085]
(3)取101.5mg abts溶于蒸馏水中，定容至25ml，制成7.4mm abts溶液。
[0086]
(4)分别吸取10ml过硫酸钾溶液和abts溶液，等体积混匀，避光，室温反应12
‑
16小时。
[0087]
(5)取一定量脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物粉末用蒸馏水分别配置成浓度为0、0.1％、0.2％、0.5％、1％和2％脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液。
[0088]
(6)将步骤(4)中反应好的溶液，用0.2mol/l磷酸盐缓冲液稀释15倍，制成abts工作液，待用。
[0089]
(7)分别吸取50μl步骤(5)中不同浓度脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液置于96孔板中，再加入150μl abts工作液，每组三个平行。室温避光反应5分钟，用酶标仪测734nm吸光度值。
[0090]
(8)所测的od值按以下公式计算：
[0091][0092]
式中d
对照
为不加脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液的abts工作液od值，d
空白
为脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液自身od值，d
样品
为脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液与abts溶液反应后的od值。
[0093]
测试结果如图7所示。由图7结果可见，本发明脱色的赤芝提取物和白肉灵芝提取物均具有显著的abts自由基清除能力。
[0094]
实施例7
[0095]
本实施例对所得灵芝提取物的酪氨酸酶抑制活性进行检测：
[0096]
(1)称取4.76mg酪氨酸酶溶于水定容至10ml，制成476μg/ml酪氨酸酶溶液，然后取1ml 476μg/ml酪氨酸酶溶液稀释至5ml配制成95.2μg/ml酪氨酸酶工作液。
[0097]
(2)取一定量的脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物粉末用蒸馏水分别配置成浓度为0、0.1％、0.2％、0.5％、1％和2％脱色的赤芝提取物或白肉灵芝灵芝提取物溶液。
[0098]
(3)称取9.88mg lopa溶于蒸馏水中定容至50ml，制成1mm lopa溶液。
[0099]
(4)分别取80μl脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液置于96孔酶标板中，再加入1mm dopa溶液120μl，最后加入50μl酪氨酸酶工作液，每组三个平行。37℃避光反应30分钟，用酶标仪测475nm吸光值od
475
。
[0100]
(5)所测的od值按以下公式计算：
[0101][0102]
式中d
对照
为不加脱色的赤芝提取物或白肉提取物溶液，只加dopa溶液和酪氨酸酶溶液的od值；d
空白
为脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液自身od值，d
样品
为脱色的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液与dopa溶液和酪氨酸酶溶液混合反应后的od值。
[0103]
测试结果如图8所示。由图8结果可见，本发明脱色的赤芝提取物和白肉灵芝提取物均具有显著的酪氨酸酶抑制活性。
[0104]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。