1.本发明涉及合成阿福豆素和儿茶素的酿酒酵母菌株及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
2.黄烷
‑3‑
醇类((flavan
‑3‑
ols))物质是植物中天然存在的一类具有生物活性的植物化学物质，已被报道显示出多种有益健康的作用，可作为抗氧化抗癌药物、保护心血管健康、参与糖尿病的预防控制。阿福豆素((+)
‑
afzelechin，afz)和儿茶素((+)
‑
catechin，cat)同为黄酮化合物中的黄烷3
‑
醇类物质，一般从植物中提取获得。在各类黄酮类化合物中，儿茶素是最有效的自由基清除剂，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌活性，可清除因氧化损伤而产生的活性氧，作为活性氧的有效清除剂，有助于防止衰老和其他因氧化损伤而发生的疾病，此外，有动物实验研究表明儿茶素可以减少肠道肿瘤的数量。阿福豆素可以调节胰腺细胞胰岛素分泌，促进胰岛素的分泌，从而改善2型糖尿病；还可以作为抗氧化剂维持心脏健康。近年来，陆续有研究在大肠杆菌或者酿酒酵母中合成黄烷
‑
3醇类化合物，选用安全模式微生物酿酒酵母作为宿主，能够在很大程度上保证产物的安全性。
3.黄烷
‑3‑
醇类物质的生物合成主要由莽草酸途径、苯丙烷途径、类黄酮合成途径组成。在莽草酸途径中，戊糖磷酸途径产生的4
‑
磷酸赤藓糖((e4p))和糖酵解途径产生的磷酸烯醇式丙酮酸((pep))在3
‑
脱氧
‑
d
‑7‑
磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶(dahps)作用下合成3
‑
脱氧
‑
d
‑7‑
磷酸阿拉伯庚酮糖酸(dahp)，接着在其他酶作用下连续反应得到芳基氨基酸、维生素、木质素、酚类物质、生物碱等；其中，苯丙氨酸或酪氨酸分别在在苯丙氨酸解氨酶(pal)和酪氨酸解氨酶(tal)作用下得到肉桂酸或对香豆酸，肉桂酸在依赖细胞色素p450的4
‑
肉桂酸羟化酶(c4h)作用下转化为对香豆酸，然后在香豆酸coa连接酶(4cl)作用下得到对香豆酰coa，1分子对香豆酰coa与3分子丙二酰coa在查耳酮合成酶(chs)作用下合成柚皮素查耳酮，并在查耳酮异构酶(chi)作用下环化得到柚皮素。柚皮素在类黄酮3’羟化酶(f3’h)、类黄酮3’，5’羟化酶(f3
’5’
h)作用下分别在b环引入了一个和两个羟基得到黄烷酮，随后被黄烷酮3
‑
羟化酶(f3h)催化得到二氢黄酮醇类(dhf)化合物，然后被二氢黄烷醇4
‑
还原酶(dfr)催化还原合成无色花青素。无色花青素可被还原酶(lar)直接还原得到儿茶素。另外，柚皮素也直接在类黄酮3羟化酶(f3h)作用下在c环引入一个羟基得到二氢黄酮醇类化合物
‑
二氢山奈酚(dhk)，然后在dfr、lar催化下得到黄烷
‑
3醇类化合物
‑
阿福豆素(图1)。现有技术中有文献记载了对酿酒酵母进行基因工程改造生成阿福豆素和儿茶素的方案，但仍存在产量较低的问题，主要原因在于dfr和lar的催化效率低，中间产物的不稳定也可能是造成终产物产量低的原因，此外，nadph的供给不足也可能限制了产量的生成。
技术实现要素：
4.为了实现阿福豆素和儿茶素的异源从头合成并提高产量，本发明在一株柚皮素异源从头合成菌株的基础上引入了的甜橙(citrus sinensis)来源的f3h和水飞蓟
(silybummarianum)来源的f3’h和cpr，并对不同植物来源的的dfr lar基因进行了筛选并确定了草莓(fragaria xananassa)来源的fadfr和葡萄(vitis vinifera)来源的vvlar，为了强化向阿福豆素、儿茶素合成的代谢通量并减少不稳定中间代谢产物无色花青素的生成，使用连接肽融合表达dfr lar基因，并使用合适强度的启动子启动dfr、lar基因的表达，最后通过强化菌株内nadph的再生进一步促进阿福豆素和儿茶素的合成，从而分别得到了阿福豆素与儿茶素的高产酿酒酵母工程菌株。
5.本发明提供了一种重组菌，所述重组菌以e32为出发菌株，在基因组上整合来源于fragaria x ananassa的dfr和来源于vitis vinifera的lar，并表达来源于c.sinens的黄酮3
‑
羟化酶f3h或是表达来源于c.sinens的黄酮3
‑
羟化酶f3h并同时表达来源于silybum marianum的黄酮3β
‑
羟化酶f3’h及其还原酶cpr。
6.在一种实施方式中，所述酿酒酵母e32为cen.pk2
‑
1d；δpdc5::gal7p
‑
fjtal
‑
tdh3t,δaro10::cyc1t
‑
aro4
k229l
‑
gal1,10p
‑
aro7
g141s
‑
adh1t
‑
g418,δgal80::trp1,δrdna::phchs
‑
gal10p
‑
gal1p
‑
ald5p
‑
mschi
‑
aro7p
‑
pc4cl
‑
tdh3p
‑
fjtal
‑
his，公开于文献《effects of metabolic pathway gene copy numbers on the biosynthesis of(2s)
‑
naringenin in saccharomyces cerevisiae》中。
7.在一种实施方式中，生产阿福豆素的重组菌是在e32基因组上整合来源于fragaria xananassa的dfr和来源于vitis vinifera的lar，并表达来源于c.sinens的黄酮3
‑
羟化酶f3h。
8.在一种实施方式中，生产儿茶素的重组菌中是在e32基因组上整合来源于fragaria xananassa的dfr和来源于vitis vinifera的lar，表达来源于c.sinens的黄酮3
‑
羟化酶f3h并同时表达来源于silybum marianum的黄酮3β
‑
羟化酶f3’h及其还原酶cpr。
9.在一种实施方式中，编码所述f3h的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述f3h由启动子gal7p启动并整合在gal2位点；所述启动子gal7p的核苷酸序列如seq id no.6所示。
10.在一种实施方式中，编码所述f3’h的核苷酸序如seq id no.2所示，编码所述cpr的核苷酸序如seq id no.3所示；所述基因f3’h和cpr由gal1,10p双向启动子启动表达并整合在spr1位点；所述gal1,10p双向启动子的序列如seq id no.7所示。
11.在一种实施方式中，所述dfr的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述lar的核苷酸序列如seq id no.5所示。
12.在一种实施方式中，利用连接肽(ggggs)2将lar、dfr依次连接，并利用启动子gal7p启动lar和dfr的表达；或者利用连接肽(ggggs)2将lar、dfr依次连接，并利用启动子gal7p启动lar和dfr的表达，并同时过表达tyr1基因。
13.在一种实施方式中，利用连接肽(eaaak)2将lar、dfr依次连接，并利用启动子erg1p启动lar和dfr的表达；或者利用连接肽(eaaak)2将lar、dfr依次连接，并利用启动子erg1p启动lar和dfr的表达，并同时过表达aro8、tyr1与zwf1。
14.在一种实施方式中，所述tyr1、zwf1、aro8分别如gene id:852464、geneid:855480、genbank:cp046087.1所示。
15.本发明提供了生产阿福豆素或儿茶素的方法，所述方法利用所述生产阿福豆素的重组菌为发酵菌株，生产阿福豆素；
16.或者利用所述生产儿茶素的重组菌为发酵菌株，生产儿茶素。
17.在一种实施方式中，将培养至对数生长期的菌液按体积比1％～5％的量接种至ypd培养基中，在28～30℃、200～220rpm下发酵不少于72h。
18.在一种实施方式中，将单菌落接种至40～50ml的sd培养基中在28～30℃、200～220rpm下培养20～24h，然后将菌液按照体积比1％～5％的量接种至20～25ml的sd培养基中，在28～30℃、200～220rpm下培养20～24h，将获得菌液全部接种于2.5l的ypd培养基中，添加终浓度为5～15g/l的碳酸钙，发酵罐温度为28～30℃，通气量为1～2vvm，控制ph为5.5
±
0.1，发酵14～15h后进行补料，并在58～60h停止补料，发酵时间不少于72h；生产阿福豆素的过程中溶氧控制在9～10％，生产儿茶素的过程中溶氧控制在28～30％。
19.在一种实施方式中，所述补料培养基：350～400g/l葡萄糖、15～18g/l kh2po4、10～11g/lmgso4·
7h2o、5～8g/l k2so4、0.5～0.6g/l na2so3、15～20ml/l微量元素a、20～25ml/l微量元素b以及相应的氨基酸缺陷因子，或还含有10～15g/l蛋白胨；所述微量元素a：5～6g/l znso
4 7h2o，0.3～0.4g/l mncl
2 4h2o，0.45～0.5g/lcocl
2 6h2o，0.45～0.5g/l na2moo
4 2h2o，2.9～3g/l cacl
2 2h2o，2.8～3g/l feso
4 7h2o，80～90ml 0.5m edta，ph＝8.0；微量元素b：0.05～0.1g/l生物素，1～2g/l泛酸钙，1～2g/l烟酸，20～25g/l肌醇，1～2g/l盐酸硫胺素，1～2g/l盐酸吡哆醛，0.01～0.05g/l对氨基苯甲酸。
20.本发明提供了所述生产阿福豆素的重组菌在制备阿福豆素及其衍生产品中的应用。
21.本发明提供了所述生产儿茶素的重组菌在制备儿茶素及其衍生产品中的应用。
22.有益效果：
23.本发明在酿酒酵母基因组的位点上整合f3h、f3’h和cpr之后，构建了可以从头合成阿福豆素与儿茶素的菌株，通过不同来源的dfr、lar基因筛选后确定了活性较高的dfr、lar组合，可以从头合成阿福豆素，通过使用连接肽融合表达dfr、lar之后，使得阿福豆素从头合成产量从7mg/l提高到61mg/l，在添加250mg/l的二氢槲皮素为底物的情况下，儿茶素的产量从19mg/l提升到53mg/l，通过选择合适强度的启动子，阿福豆素和儿茶素的从头合成产量分别为64mg/l、27mg/l。最后在阿福豆素和儿茶素的从头合成菌株中强化了nadph的再生，儿茶素的从头合成产量从23mg/l提升至41mg/l。将重组菌株在发酵罐条件下进行发酵并优化发酵条件，最终能够使得儿茶素含量提升至321.3mg/l，使得阿福豆素产量提升至500.5mg/l。
附图说明
24.图1为阿福豆素和儿茶素合成途径示意图。
25.图2为dhk和dhq产量示意图。
26.图3为不同植物来源的dfr、lar筛选；(a)不同植物来源的dfr、lar基因对阿福豆素产量的影响；(b)不同植物来源的dfr、lar基因对儿茶素产量的影响；(c)lcms
‑
it
‑
tof验证阿福豆素的生成；(d)lcms
‑
it
‑
tof验证儿茶素的生成。
27.图4为不同类型的连接肽融合表达dfr、lar；(a)不同类型的连接肽融合表达dfr、lar基因对阿福豆素产量的影响；(b)不同类型的连接肽融合表达lar、dfr基因对阿福豆素产量的影响；(c)不同类型的连接肽融合表达dfr、lar基因对儿茶素产量的影响；(d)不同类型的连接肽融合表达lar、dfr基因对儿茶素产量的影响。
28.图5为不同类型的启动子启动lar
‑
linker
‑
dfr表达对阿福豆素和儿茶素产量的影响；(a)不同类型的启动子启动lar
‑
(ggggs)2‑
dfr；(b)不同类型的启动子启动lar
‑
(eaaak)2‑
dfr。
29.图6为强化nadph的再生对阿福豆素和儿茶素产量的影响；(a)强化nadph的再生对阿福豆素产量的影响；(b)强化nadph的再生对儿茶素产量的影响。
30.图7为5l罐上优化阿福豆素与儿茶素产量；(a)阿福豆素产量；(b)儿茶素产量。
具体实施方式
31.(一)培养基
32.ynb培养基：0.72g/l酵母氮源基础培养基、20g/l葡萄糖、50mg/l亮氨酸、50mg/l色氨酸、50mg/l组氨酸、50mg/l尿嘧啶。
33.ypd培养基：10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖。
34.sd
‑
leu筛选培养基：0.72g/l酵母氮源基础培养基、20g/l葡萄糖、50mg/l亮氨酸
35.sd
‑
leu
‑
his
‑
trp
‑
筛选培养基：0.72g/l酵母氮源基础培养基、20g/l葡萄糖、50mg/l亮氨酸、50mg/l色氨酸、50mg/l组氨酸。
36.sd
‑
筛选培养基：0.72g/l酵母氮源基础培养基、20g/l葡萄糖。
37.固体培养基中添加2g/l的琼脂粉。
38.(二)酿酒酵母的感受态制备：酿酒酵母感受态制备使用frozen
‑
ez yeast transformation ii化转试剂盒，30℃，与10ml ypd培养基培养酿酒酵母菌至中数量级(5
×
106‑2×
107个/ml或od
600
＝0.8
‑
1.0)。以下步骤室温进行。
39.1、500
×
g离心细胞4min，去除上清；
40.2、加入10ml ez1溶液清洗沉淀，重新离心沉淀细胞，去除上清；
41.3、加入1ml ez2溶液重悬沉淀细胞。
42.(三)酿酒酵母的转化：
43.1、取50μl感受态细胞与2μgdna片段、1μgsgrna质粒(体积少于5μl)混合；加入500μlez3溶液，完全混合；
44.2、30℃孵育45min，孵育过程中轻弹或低俗涡旋2
‑
3次让其混匀；
45.3、从转化混合液中取50
‑
150μl到适当营养缺陷型平板上。
46.4、30℃平板孵育3天长出转化子。
47.pcr所用2
×
phantamaxmastermix购自南京诺唯赞公司。
48.infusion
‑
cloning试剂盒购自南京诺唯赞公司。
49.quickcut
tm bamhi购自大连takara公司。
50.taqpcrmastermix(上海生工生物工程有限公司)。
51.(四)菌株发酵方法
52.挑取单菌落接种于装有5ml sd选择培养基的50ml摇瓶在30℃、220rpm下培养12
‑
16h至对数生长期后，按1％(v/v)接种量转接至装有25ml ypd培养基的250ml摇瓶中，30℃、220rpm下发酵72h结束。
53.(五)检测方法
54.发酵72h结束后，收集400μl发酵液并加入同体积的甲醇，剧烈振荡混匀后，8000r/
pathway gene copy numbers on the biosynthesis of(2s)
‑
naringenin in saccharomyces cerevisiae，此菌株以c800为出发菌株)作为出发菌株，使用引物gal2
‑
up
‑
f/gal2
‑
up
‑
r和gal2
‑
down
‑
f/gal2
‑
down
‑
r从c800基因组中扩增出gal2up和gal2down片段作为基因整合的上下游同源臂；使用引物gal7p
‑
f/gal7p
‑
r从c800基因组中扩增出启动子gal7p；使用引物从实验室保藏质粒中扩增出来源于c.sinens并经过密码子优化的基因csf3h(核苷酸序列如seq id no.1所示)；使用引物cyc1t
‑
f/cyc1t
‑
r，从c800基因组中扩增终止子cyc1t。
62.将上述得到的所有的片段经过电泳验证并纯化后通过gibson组装将上述片段连接在商业质粒pmd19t上得到质粒sc276，在此质粒上，基因csf3h由启动子gal7p启动，并由终止子cyc1t终止；使用引物gal2
‑
up
‑
f/gal2
‑
down
‑
r以sc276为模板扩增出整合用片段，使用酵母转化试剂盒在e32的gal2位点整合扩增出的片段，得到dhk从头合成菌株af07，dhk产量为174mg/l(图2)。
63.(2)dhq从头合成菌株的构建
64.使用引物spr1
‑
up
‑
f/spr1
‑
up
‑
r和spr1
‑
down
‑
f/spr1
‑
down
‑
r从c800基因组中扩增出spr1up和spr1down片段作为上下游同源臂，使用引物gal1、10p
‑
f，gal1、10p
‑
r从c800基因组中扩增出gal1,10p双向启动子，使用引物adh1t
‑
f/adh1t
‑
r和cyc1t
‑
f2/cyc1t
‑
r2分别从c800基因组中扩增出终止子adh1t和cyc1t，使用引物从实验室保藏质粒中扩增出基因smf3’h(核苷酸序如seq id no.2所示)和smcpr(核苷酸序如seq id no.3所示)。
65.通过gibson组装将上述片段连接在商业质粒pmd19t上得到质粒sc046，以质粒sc046为模板使用引物spr1
‑
up
‑
f/spr1
‑
down
‑
r扩增出片段，将扩增得到的片段整合到af07的spr1处，得到dhq从头合成菌株af11，dhq产量为118mg/l(图2)。
66.表2引物及序列
67.[0068][0069]
实施例2不同植物来源的dfr lar筛选
[0070]
为了筛选到活性较高的dfr和lar，对10个不同来源的dfr基因和2个不同来源的lar基因进行了游离表达，基因及来源见表3。
[0071]
表3dfr和lar的来源及序列
[0072][0073]
所有的dfr和lar基因均由南京金唯智公司合成，并进行了密码子优化，通过组合不同来源的dfr和lar基因并把它们分别构在py26tef
‑
gpd表达载体上的m13
‑
47和m13
‑
48序列之间，对应地，分别由ino1p(seq id no.8)，tdh1p(seq id no.9)启动子进行启动表达，共得到二十个质粒，ck为含有py26空质粒的对照菌株。通过酵母转化试剂盒分别转入af07
optimization for efficient(2s)
‑
naringenin production from p
‑
coumaric acid in saccharomyces cerevisiae.j agric food chem,2020.68(25):p.6884
‑
6891.)中选择了6个梯度启动子分别用于调节vvlar
‑
(ggggs)2‑
fadfr和vvlar
‑
(eaaak)2‑
fadfr的表达水平。启动子分别为ino1p、tdh1p、gal7p、erg1p、rps5p和ade6p。使用xxx
‑
f/xxx
‑
r(表5所示的引物，其中xxx代表启动子名称)从c800基因组上扩增启动子片段。同样使用py26质粒在af07与af11菌株中游离表达，结果显示，py26
‑
gal7p
‑
vvlar
‑
(ggggs)2‑
fadfr和py26
‑
erg1p
‑
vvlar
‑
(eaaak)2‑
fadfr可分别从头合成阿福豆素和儿茶素64mg/l与27mg/l(图5)，因此得到了阿福豆素从头合成菌株af12和儿茶素从头合成菌株af13。
[0082]
表5引物/启动子序列
[0083][0084][0085]
实施例5：强化nadph再生为dfr和lar提供足够的辅因子
[0086]
nadph是dfr、lar催化过程的辅因子，为了增加nadph的含量以保证dfr、lar正常的催化过程，分别在菌株af12和af13中过表达几种已经报道的nadph再生基因，包括tyr1(gene id:852464)，zwf1(geneid:855480)，bdh1
e221s/i222r/a223s
(核苷酸序列如seq id no.10所示)，此外，aro8(genbank:cp046087.1)，由于可以产生黄酮类化合物的前体
‑
酪氨酸，同时与tyr1具有协同作用，也被用于试验是否能提升产量，由于af12、af13菌株中已游离表达了py26质粒，此次nadph再生相关基因选择在prs425质粒中游离表达，表达框构在prs425质粒的m13
‑
47和m13
‑
48序列之间。结果显示，在af12菌株中过表达tyr1基因(即为af14菌株)时最有利于阿福豆素产量的提升，在af13菌株中过表达aro8、tyr1与zwf1(即为af15菌株)时，使得儿茶素产量从23mg/l提升至41mg/l(图6)。
[0087]
实施例6：5l发酵罐上优化阿福豆素和儿茶素的产量
[0088]
进一步验证af14、af15产阿福豆素与儿茶素的能力，使用5l发酵罐对菌株进行放
大培养。挑取单菌落使用装有5ml sd选择培养基的50ml摇瓶在30℃、220rpm下培养24h后按1％(v/v)接种量转接至装有25ml sd选择培养基的250ml摇瓶中，同样条件下培养24h后全部接种于装有2.5l ypd培养基的5l发酵罐中，控制发酵罐温度为30℃，通气量为1vvm，控制ph为5.5
±
0.1，初始搅拌转速为200rpm，搅拌转速与溶氧关联，设置溶氧控制在10％，搅拌转速在200
‑
600rpm。发酵15h后按照5ml/h进行补料(补料培养基：15g/l蛋白胨、400g/l葡萄糖、18g/l kh2po4、10.24g/lmgso4·
7h2o、7g/l k2so4、0.56g/l na2so3、20ml/l微量元素a、24ml/l微量元素b以及相应的氨基酸缺陷因子)，60h结束补料。定时取样记录od、残糖与目标产物积累量。(微量元素a：5.75g/l znso
4 7h2o，0.32g/l mncl
2 4h2o，0.47g/lcocl
2 6h2o，0.48g/l na2moo
4 2h2o，2.9g/l cacl
2 2h2o，2.8g/l feso
4 7h2o，80ml 0.5m edta，ph＝8.0。微量元素b：0.05g/l生物素，1g/l泛酸钙，1g/l烟酸，25g/l肌醇，1g/l盐酸硫胺素，1g/l盐酸吡哆醛，0.02g/l对氨基苯甲酸)。
[0089]
按照初始培养条件在5l发酵罐中最终得到206.5mg/l阿福豆素与72.4mg/l儿茶素，在添加10g/l的碳酸钙后，产量显著提升，其中阿福豆素为409.1mg/l，儿茶素为123.3mg/l；为了进一步优化培养条件，去除了补料培养基中15g/l的蛋白胨后，阿福豆素产量提升至500.5mg/l，儿茶素产量提升至145.8mg/l；最后，通过将溶氧提升至30％，阿福豆素产量稍有下降，儿茶素的最终产量提升至321.3mg/l(图7)。
[0090]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。