一种樱桃酵素果渣中角鲨烯、提取方法、提取装置及应用与流程

1.本发明属于角鲨烯提取技术领域，尤其涉及一种樱桃酵素果渣中角鲨烯、提取方法、提取装置及应用。


背景技术：

2.具有“北方春果第一枝”美誉的樱桃，香甜可口、营养丰富，含有多种维生素，其中维生素a的含量比葡萄、苹果多4-5倍。另外樱桃矿物质含量也非常丰富，尤其是铁含量居水果之首。樱桃亩产较其他农作物高出数倍，目前，我国的樱桃种植面积和产量均已居世界第一，其中山东省樱桃产量已经超过全国总产量的50％，产生了巨大的经济和社会效益。
3.樱桃柔软多汁，成熟期较短，每年5月集中上市，加之气温较高，果实极易腐烂变质，鲜食品质显著下降，造成极大资源浪费，限制其远销和大规模生产种植。因此，除了鲜食以外，大量的樱桃被加工成了樱桃酒、樱桃酵素、樱桃果脯等产品，为消费者的日常需求提供了更多的选择。
4.然而，樱桃加工业会产生大量的加工副产物，如果皮、果核、发酵皮渣等，研究表明这些副产物中富含多种有益成分，如多酚类物质、膳食纤维、不饱和脂肪酸、角鲨烯、植物甾醇等。如果这些副产物得不到合理利用而排放到环境中，不仅会污染环境，还会造成大量的资源浪费。
5.樱桃酵素是一种以樱桃浆果为主要原料，通过自然发酵或人工接种纯化菌种发酵的方式获得一种植物发酵饮品，富含多种有机酸、矿物质、活性酶、多糖等功能成分，是当下较为流行的健康食品。在樱桃酵素的发酵生产过程中，会产生大量的果核、皮渣和残留菌体等副产物。
6.角鲨烯又名三十碳六烯，是类固醇物质和类萜物质的生物合成前体，属于一种萜烯类化合物现有研究表明具有多种生理功效，如提高动物的耐缺氧能力、抗氧化、改善心脏功能，增强体质、净化体内垃圾、护肝、抗衰老、预防糖尿病、修复细胞、增强抵抗力等作用，作为保健食品在市场上需求较大。很多食物中含有角鲨烯，其中鲨鱼肝油中含量较高，也是目前角鲨烯提取的主要原料来源。然而深海鲨鱼是珍贵的保护动物，生长率和繁殖率都很低，但保健品市场如此大量的角鲨烯需求，单纯采用深海鲨鱼作为角鲨烯的来源，势必会导致海洋生态失衡，所以从其他可再生资源中提取角鲨烯已成必然趋势。近些年来，出现了采用植物提取角鲨烯的报道，如中国专利(专利申请号为200910069670.8)“以橄榄油为原料提取高纯度角鲨烯的方法”；又如中国专利(专利申请号为201010190275.8)“从植物油脱臭馏出物中提取角鲨烯的方法”；中国专利(专利申请号为200410022116.1)“罗汉果角鲨烯及其制备方法”。然而目前发现含有角鲨烯的植物资源蓄积量少，原料成本高，导致采用植物原料提取角鲨烯开发利用有一定的难度。
7.超临界co2萃取技术是一种新型高效的提取技术，通常用于具有一定生物活性物质的提取，该提取技术中用的萃取剂为处于临界状态的co2，属于一种无毒、无腐蚀性、纯度高、易于再循环利用的绿色溶剂。与常见的有机溶剂萃取法相比，超临界co2萃取物中没有
溶剂残留，同时co2的临界压力与临界温度较为温和，萃取过程可以在较低的压力、温度下进行，特别适合某些热敏性物质的提取，该技术已被应用于各种科学和工业生产领域。
8.角鲨烯用途越来越广泛，市场需求量也越来越大，有限的角鲨烯资源已不能满足人们的需要，所以探索新的角鲨烯资源具有十分重要的意义。
9.通过上述分析，现有技术存在的问题为：
10.(1)现有技术中，对樱桃加工业产生大量的加工副产物，如果皮、果核、发酵皮渣存在的角鲨烯有益成分没有再利用。易造成这些副产物得不到合理利用而排放到环境中，不仅会污染环境，还会造成大量的资源浪费。
11.(2)现有技术中，从含有角鲨烯的植物资源进行角鲨烯提取，原料成本高，导致采用植物原料提取角鲨烯开发利用有一定的难度。
12.(3)现有角鲨烯提取技术中，不能获得提取角鲨烯的最佳参数，造成角鲨烯提取纯度低，操作过程不易控制，生产成本高，实用性差。
13.为了更好的利用樱桃酵素的发酵生产过程中产生大量的果核、皮渣和残留菌体等副产物发酵废弃物，本发明提出了一种利用超临界co2萃取的方法提取其中的活性成分——角鲨烯。


技术实现要素：

14.为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种樱桃酵素果渣中角鲨烯、提取方法、提取装置及应用。所述技术方案如下：
15.根据本发明公开实施例的第一方面，提供一种樱桃酵素果渣中角鲨烯的提取方法，包括：
16.选用樱桃酵素发酵副产物作为角鲨烯的提取原料，通过对超临界co2的萃取压力、萃取温度、co2流量、萃取时间多个变量进行优化；获得采用超临界co2萃取樱桃酵素发酵废弃物中提取角鲨烯的最佳参数。
17.在本发明一实施例中，根据权利要求1所述的樱桃酵素果渣中角鲨烯的提取方法，其特征在于，所述对超临界co2的萃取压力变量包括：5mpa、10mpa、15mpa、20mpa、25mpa。
18.在本发明一实施例中，所述对超临界co2的萃取温度变量包括：25、30、35、40、45℃。
19.在本发明一实施例中，所述对超临界co2的co2流量变量包括：2l/h、4l/h、6l/h、8l/h、10l/h。
20.在本发明一实施例中，所述对超临界co2的停留时间变量包括：45min、65min、85min、105min、125min。
21.在本发明一实施例中，以角鲨烯萃取量为指标，对超临界co2的萃取压力、萃取温度、co2流量、萃取时间各个单因素进行优化；并以此为基础，采用中心组合试验对关键因素进一步优化，获得超临界co2萃取的最佳参数为：
22.萃取压力20mpa，萃取温度42℃，co2流量6l/h、85min的萃取时间。
23.角鲨烯萃取量计算公式如下：
24.n＝x
×
y-1
。
25.其中：n为角鲨烯产量，单位mg/g；x为根据标准曲线得到的角鲨烯质量，单位mg；y
为进入萃取装置的原料干重，单位g。
26.在本发明一实施例中，角鲨烯的检测方法：采用气相色谱法gc检测萃取物中角鲨烯的含量；将进入超临界co2设备分离釜的萃取物溶解在20ml正己烷中，全部收集溶液到试管中；利用氮吹仪将试管中的正己烷吹干，得到油状物样品；加入2.5mol/l naoh溶液，80℃下反应1h，使油脂中的脂肪酸完全皂化；冷却至室温，加入适量饱和nacl溶液和正己烷溶液，振荡并静置分层；收集上层溶液，用0.2μm滤膜过滤，得到的滤液用于气相色谱分析；
27.气相色谱检测条件：采用agilent 7890a气相色谱仪，色谱柱型号为hp-5；载气为高纯氮气，恒流模式，流速1ml/min；进样体积为1μl，检测器为氢离子火焰检测器；
28.升温程序为：初温100℃，以15℃/min升至250℃，保持10min；角鲨烯标准品溶于色谱级正己烷，通过响应峰面积s－角鲨烯含量c拟合制作标准曲线；根据待测样品中角鲨烯的响应峰面积测定角鲨烯含量，单位为mg。
29.根据本发明公开实施例的第二方面，提供一种樱桃酵素果渣中角鲨烯的提取方法提取的角鲨烯。
30.根据本发明公开实施例的第三方面，提供一种所述角鲨烯在制备提高动物的耐缺氧能力、抗氧化、改善心脏功能，增强体质、净化体内垃圾、护肝、抗衰老、预防糖尿病、修复细胞、增强抵抗力作用保健品上的应用。
31.根据本发明公开实施例的第四方面，提供一种实施所述樱桃酵素果渣中角鲨烯的提取方法的樱桃酵素果渣中角鲨烯提取装置。
32.本发明公开的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
33.现有角鲨烯提取方法都会涉及到有机溶剂，存在污染环境的可能。超临界co2因为其特殊的存在形式，能够实现角鲨烯的绿色提取，使有机溶剂的使用率降低到0，提取时间缩短1倍以上，得到的角鲨烯样品纯度提高40％以上。本发明选用樱桃酵素发酵副产物作为角鲨烯的提取原料，通过对超临界co2的萃取压力、萃取温度、co2流量、停留时间4个变量进行了优化，最终获得了采用超临界co2萃取樱桃酵素发酵废弃物中提取角鲨烯的最佳参数。
34.提高了角鲨烯的纯度，解决了对樱桃加工业产生大量的加工副产物有益成分没有再利用，实现了资源的回收。
35.本发明中co2的临界压力与临界温度较为温和，萃取过程可以在较低的压力、温度下进行，特别适合某些热敏性物质的提取；而且本发明原料成本低，提取角鲨烯简单易行。操作过程易控制，实用性强。
36.相比于现有技术，本发明的优点进一步包括：1、提取过程不涉及有机溶剂，安全绿色无污染；2、提取时间大幅度缩短，提高生产效率；3、提取的角鲨烯纯度较普通有机溶剂方法要高，提高产品品质。
37.当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明公开。
附图说明
38.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
39.图1是本发明实施例提供的樱桃酵素果渣中角鲨烯的提取方法流程图。
40.图2是本发明实施例提供的萃取压力对角鲨烯提取量的影响图。
41.图3是本发明实施例提供的萃取温度对角鲨烯提取量的影响图。
42.图4是本发明实施例提供的co2流量对角鲨烯提取量的影响图。
43.图5是本发明实施例提供的萃取时间对角鲨烯提取量的影响图。
44.图6是本发明实施例提供的影响角鲨烯提取效率的各因素交互效应图；
45.其中，图6(a)为萃取压力与萃取温度交互效应下影响角鲨烯提取量示意图；图6(b)为萃取压力与co2流量交互效应下影响角鲨烯提取量示意图；图6(c)为萃取温度与co2流量交互效应下影响角鲨烯提取量示意图。
46.图7是本发明实施例提供的角鲨烯标准品标准曲线。
具体实施方式
47.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的装置和方法的例子。
48.如图1所示，本发明公开实施例所提供的樱桃酵素果渣中角鲨烯的提取方法，包括：
49.s101，选取经冷冻干燥后的樱桃酵素发酵副产物作为角鲨烯的提取原料，每次实验称取30g已经粉碎过筛(60目)后的原料作为萃取样本，将其置入萃取釜内的物料桶中，在物料桶口放置一块压制的陶瓷片并压紧，以防止样品由于co2流动过程中的卷吸作用离开萃取釜堵塞系统管道。
50.s102，对超临界co2的萃取压力、萃取温度、co2流量、萃取时间各个变量进行单因素优化和响应面优化。
51.s103，获得采用超临界co2萃取樱桃酵素发酵废弃物中提取角鲨烯的最佳参数。即萃取压力20mpa，萃取温度42℃，co2流量6l/h、85min的萃取时间。
52.下面结合具体实验对本发明的技术方案作进一步描述。
53.超临界co2萃取装置
54.本发明所采用的超临界co2萃取装置购自江苏省南通市华安超临界有限公司，该萃取系统由如下单元部件构成：一个液压泵、一个冷凝器、一个2l萃取釜、两个2l分离釜。萃取系统最大的设置压力为40mpa，最高温度为100℃。co2从气瓶中进入冷凝器，在冷凝器中温度降至0℃，以保证稳定的co2供给。液压泵将冷凝器中液化的co2送入萃取釜，对萃取釜进行加压。萃取釜和分离釜分别配有换热器和温控设备，以实现对萃取和分离过程的加热和温度调控。压力与温度达到设定温度后，物料中的溶质融入超临界co2中跟随co2进入分离釜，进入分离釜的co2压力与温度同时降低，退出超临界态，溶质从co2中析出。从分离釜出来的co2通过循环管路重新进入萃取系统，实现co2的重复利用。
55.实验方案：
56.樱桃酵素副产物经过冷冻干燥后，粉碎，过60目筛，得到待萃取的样本。每次实验称取30g处理好的样品，将其置入萃取釜内的物料桶中，在物料桶口放置一块压制的陶瓷片并压紧，以防止样品由于co2流动过程中的卷吸作用离开萃取釜堵塞系统管道。
57.单因素实验
58.每个因素各设置5个试验点。分别为萃取压力：5mpa、10mpa、15mpa、20mpa、25mpa；萃取温度：25、30、35、40、45℃；co2流量：2l/h、4l/h、6l/h、8l/h、10l/h；停留时间：45min、65min、85min、105min、125min。
59.以角鲨烯萃取量为指标，对以上单因素进行优化，获得超临界co2萃取的最佳参数。角鲨烯萃取量计算公式如下：
60.n＝x
×
y-1
。
61.其中：n为角鲨烯产量，单位mg/g；x为根据标准曲线得到的角鲨烯质量，单位mg；y为进入萃取装置的原料干重，单位g；
62.下面结合具体实验对本发明的技术方案作进一步描述。
63.实验所用樱桃酵素发酵废弃物均由山东绿丰生态农业股份有限公司提供，将废弃物(果核、果梗、果皮、菌体沉淀等)在冷冻干燥机中冻干至恒重，装入高速粉碎机中粉碎成粉末，过60目筛，收集筛下物，粒径约为250μm，用密封袋装好，保存在干燥器中以备使用。co2由青岛鲁东气体有限公司提供，纯度为99.99％。角鲨烯标准品由sigma公司提供，纯度≥99％.
64.角鲨烯的检测方法：本发明采用气相色谱法gc检测萃取物中角鲨烯的含量。将进入超临界co2设备分离釜的萃取物溶解在20ml正己烷中，全部收集溶液到试管中。利用氮吹仪将试管中的正己烷吹干，得到油状物样品。加入2.5mol/l naoh溶液，80℃下反应1h，使油脂中的脂肪酸完全皂化。冷却至室温，加入适量饱和nacl溶液和正己烷溶液，振荡并静置分层。收集上层溶液，用0.2μm滤膜过滤，得到的滤液用于气相色谱分析。
65.气相色谱检测条件：采用agilent 7890a气相色谱仪，色谱柱型号为hp-5(30m
×
0.25mm
×
0.20μm)；载气为高纯氮气，恒流模式，流速1ml/min；进样体积为1μl，检测器为氢离子火焰检测器。升温程序为：初温100℃，以15℃/min升至250℃，保持10min。角鲨烯标准品(cas number 111-02-4，99.0％纯度，sigma公司)溶于色谱级正己烷，通过响应峰面积s－角鲨烯含量c拟合制作标准曲线(见图7)。根据待测样品中角鲨烯的响应峰面积测定角鲨烯含量，单位为mg。
66.结果：
67.(1)萃取压力对萃取结果的影响
68.设置萃取温度30℃、co2流量8l/h、停留时间120min的操作条件，分析萃取压力对萃取率的影响，选取5mpa、10mpa、15mpa、20mpa、25mpa为试验点进行考察。如图2萃取压力对萃取率的影响所示，压力变化对角鲨烯提取量的影响较为明显。萃取量的提升通常归因于3个因素，即颗粒粒径、传质系数和溶解度，本实验中各组实验样本粒径分布相同，不考虑粒径的影响。现有技术已经证实压力增长会引起溶解度的非线性增长。萃取压力升高，co2流体密度增大，增加了原料中溶质的溶解及缩短分子间的传质距离，利于萃取。同时，在高压下，植物细胞或微生物细胞壁得到充分破裂，内容物能够充分溶出，也能够提高角鲨烯的萃取效率。但压力过高，溶质的扩散系数减小，传质阻力增大，导致提取量降低。
69.(2)萃取温度对萃取结果的影响
70.设置萃取压力20mpa、co2流量8l/h、停留时间120min的操作条件，研究萃取温度对角鲨烯萃取效率的影响实验，选取25、30、35、40、45℃为试验点进行分析。
71.由图3萃取温度对萃取量的影响可知，随着萃取温度的升高，萃取量先上升后降低，温度为40℃时，萃取量达到最高。由于温度升高，使得对流传质系数增大，萃取速率提升。另一方面，温度的升高使得超临界co2的密度降低，减小了萃取物的溶解度，不利于副产物中角鲨烯提取。
72.当温度低于40℃时，温度升高对对流传质系数的影响大于对溶解度的影响，萃取效率上升。而高于40℃时，对流传质系数随温度升高而增大的速率降低，无法弥补溶解度迅速降低带来的萃取速率下降，萃取效率开始降低。
73.(3)co2流量对萃取结果的影响
74.设置萃取压力20mpa、萃取温度40℃、停留时间120min的操作条件研究co2流量对角鲨烯提取量的影响，选取2l/h、4l/h、6l/h、8l/h、10l/h为试验点进行考察。如图4所示，co2流量对萃取量的影响与萃取温度相似。当co2流量增大，萃取釜入口处的co2流速增大，使得萃取釜中的物料与超临界co2充分接触混合，提高了萃取速率。其次，增大co2流量，意味着更多co2参与萃取过程，溶剂体积增大，这两方面的叠加效应直接提升了角鲨烯的提取效率。如图4中所示，co2流量增加到8l/h时，萃取率达到最大值，随后开始降低。这是由于更大的co2流量减少了超临界co2与溶质的接触时间，传质过程中角鲨烯还未充分进入超临界co2流体中便被迫分离，降低了萃取效率，萃取量开始降低。
75.(4)萃取时间对萃取结果的影响
76.设置萃取压力20mpa，萃取温度40℃，co2流量8l/h的萃取条件下，角鲨烯的萃取量如图5所示。从图5中可以看出，随着萃取时间的不断延长，萃取率呈现上升趋势。但当萃取时间超过85min后，角鲨烯的萃取效率增速明显放缓，基于成本和提取效率综合考虑，萃取时间并非越长越好，选取85min为最佳时间。
77.(5)响应面法优化角鲨烯提取条件
78.在单因素基础上，对超临界co2的萃取温度，压力及co2流量3个关键因素进一步综合考虑，观察各个因素间的交互作用对角鲨烯提取量的影响。如图6提供的影响角鲨烯提取效率的各因素交互效应图所示。其中，图6(a)为萃取压力与萃取温度交互效应下影响角鲨烯提取量示意图；图6(b)为萃取压力与co2流量交互效应下影响角鲨烯提取量示意图；图6(c)为萃取温度与co2流量交互效应下影响角鲨烯提取量示意图。
79.实验中各因素的设置水平及组合实验结果见表1、表2所示。利用desigh expert10.0对实验结果进行回归拟合及统计分析，得到超临界co2萃取角鲨烯提取量与各因素间的回归方程如下：
80.角鲨烯提取量y＝-9.7+0.47
×
x1+0.15
×
x2+0.69
×
x
3-0.004
×
x1x2+0.001
×
x1x
3-0.005
×
x2x
3-0.007
×
x
12-0.037
×
x
32
,
81.其中x1代表萃取压力，x2代表萃取温度，x3代表co2流量。
82.表1中心组合实验(响应面法)变量及其水平。
[0083][0084]
注：a代表萃取压力；b代表萃取温度；c代表co2流量。
[0085]
表2中心组合实验(响应面法)设计及结果
[0086][0087]
统计分析结果显示该回归方程模型具极显著性(p＜0.01)，失拟项不显著(p＞0.05)，表明回归方程具有显著意义。方程相关系数r2＝0.96，表明实验结果与预测结果相关性高，说明方程能解释96％的响应值变化，可用于角鲨烯提取结果预测。据方差分析结果可判断，因素x1(萃取压力)、x2(萃取温度)均有极显著影响(p＜0.01)；二次项x
12
、x
32
存在极显著影响(p＜0.01)，表明因萃取压力和温度对提取量存在显著的曲线效应；因素交互项x1x2对提取量影响极显著(p＜0.01)，表明萃取压力和温度之间存在极显著的交互效应。由f值可判断，因素影响主次顺序为:萃取压力＞萃取温度＞co2流量。
[0088]
利用回归方程预测樱桃酵素副产物中角鲨烯的最优萃取条件为:即萃取压力20mpa，萃取温度42℃，co2流量6l/h、85min的萃取时间，在此条件角鲨烯的提取量为0.85mg/g。
[0089]
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的公开后，将容易想到本公开的其它实施方案。本技术旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识
或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由所附的权利要求指出。
[0090]
应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围应由所附的权利要求来限制。