贝莱斯芽孢杆菌YJ02、其微生物制剂及应用

贝莱斯芽孢杆菌yj02、其微生物制剂及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌yj02、其微生物制剂及应用。


背景技术：

2.花生是一种食、油兼用的重要经济作物。近年来，花生种植面积不断增加，但连作现象明显，过度施肥，花生病害发生也随之增加；其中，花生白绢病时花生病害中危害较大的一种土传真菌病害，已发展为花生生产中重要病害之一，成为制约花生产量和质量提升的重要因素。
3.花生白绢病是由齐整小核菌侵染所引起的、发生在花生上的病害，且该菌产生的菌核可以在土壤中存活多年，造成持续的土传污染。花生在各个生育期均可受白绢病菌侵染，主要为害植株茎部、果柄、荚果及根部。在被害部位形成白色绢丝状菌丝。在气候比较潮湿、温度较高的条件下，在茎基部、地面和周围的杂草上会出现大量的菌丝，呈蛛网状，在临近的地面也会出现，进而传染到植株上。苗期发病时，白色菌丝通常是在接近地面的茎基部和附近的土壤表面形成，病部呈现的症状为暗褐色而有光泽；幼株茎基部被病斑包围直到萎黄枯死；成株期发病时，接近地面的茎部先变为褐色，被害部长出白色绢丝状菌丝，形成菌核。菌核最先为白色，慢慢变为黄褐色。被害植株的叶片发生黄化，逐渐变为褐色，并变软腐，表皮脱落，呈现出纤维状叶片，最终叶片凋萎，植株因萎蔫而死亡。
4.目前，花生白绢病的防治可以从选种整地、合理轮作、测土配方、合理施肥、田间管理、药剂防治等方面入手，开展综合防治策略。在花生生产中主要依靠化学药剂防治花生白绢病，如噻呋酰胺、嘧菌酯。然而，随着化学药剂的使用量增加，有害菌的抗药性也随之增强；且农药的广泛使用也使得大量化学物质长期存在于土壤中，污染土壤，打破土壤生态平衡；随着进入生物组织，在食物链中不断传递、迁移，对大气、水源造成污染，也对长期生活在农业生态系统中的人类构成危害。
5.因此，亟待研发更丰富的替代农药的治理技术，以期减少化学药剂的使用，从而实现花生白绢病的绿色防治。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种贝莱斯芽孢杆菌yj02、其微生物制剂，并应用于花生白绢病等病害的生物防治中，以期能够解决化学农药带来的有害菌抗药性增强和环境污染的技术问题。
7.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：筛选得到一株贝莱斯芽孢杆菌yj02，其分类命名为bacillus velezensis，于2021年8月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其保藏编号为cgmcc no. 23110。
8.本发明还提供一种微生物制剂，包含所述的贝莱斯芽孢杆菌yj02的菌悬液。
9.优选的，所述菌悬液中所述的贝莱斯芽孢杆菌yj02的有效活菌数为1
×
107～1
×
109cfu
•
m l
‑1；尤其是有效活菌数为1
×
108cfu
•
m l
‑1时，生防效果最佳。
10.优选的，所述菌悬液的制备方法为：活化所述贝莱斯芽孢杆菌yj02 后，挑取单菌落接种于培养液中，培养 18～30 h，即得。
11.进一步的，所述培养的温度控制为28～32℃；转速控制为150～200rpm。
12.本发明将所述贝莱斯芽孢杆菌yj02或所述微生物制剂在促进花生生长中应用。
13.本发明将所述贝莱斯芽孢杆菌yj02或所述微生物制剂在抑制有害菌生长中应用。优选的，所述有害菌为镰孢菌、炭疽、色二孢菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌中的至少一种。
14.本发明将所述贝莱斯芽孢杆菌yj02或所述微生物制剂在齐整小核菌引起的植物病害生物防治中应用。优选的，所述植物病害为花生白绢病。
15.与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：1.本发明筛选出一株贝莱斯芽孢杆菌yj02，其分类命名为bacillus velezensis，其保藏编号为cgmcc no. 23110。
16.2.本发明的贝莱斯芽孢杆菌yj02具有广谱抑菌功能，对镰孢菌、炭疽、色二孢菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌等花生根茎病害病原菌均有较强的抑制作用。
17.3.本发明的贝莱斯芽孢杆菌yj02菌剂能够有效提高花生的的株高、鲜重、根长和根重，有效促进花生的生长。
18.4.本发明的贝莱斯芽孢杆菌yj02菌剂对环境友好，生产成本低廉，能够实现作物病害绿色防控，有利于农作物的无公害生产。
附图说明
19.图1为菌株yj02对花生白绢病菌的平板抑制对比试验照；图中，右边平板为空白对照。
20.图2为pcr 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
21.图3为yj02菌株的进化树。
22.图4为菌株yj02对镰孢菌的平板抑制对比试验照；图中，下边平板为空白对照。
23.图5为菌株yj02对炭疽的平板抑制对比试验照；图中，下边平板为空白对照。
24.图6为菌株yj02对色二孢菌的平板抑制对比试验照；图中，下边平板为空白对照。
25.图7为菌株yj02对黑曲霉菌的平板抑制对比试验照；图中，下边平板为空白对照。
26.图8为菌株yj02对黄曲霉菌的平板抑制对比试验照；图中，下边平板为空白对照。
27.图9为实施例3中清水对照组的盆栽花生植株。
28.图10为实施例3中yj02菌悬液处理组的盆栽花生植株。
具体实施方式
29.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
30.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的
试剂和培养基如无特别说明，均为市售常规试剂和培养基；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
31.实施例1：贝莱斯芽孢杆菌yj02的分离、筛选和鉴定（1）样品采集于 2019 年9月21日由王振宇等在河南省新乡延津县采集白绢病罹病花生荚果，用保鲜袋带回，备用。
32.（2）分离和纯化将白绢病罹病花生荚果用自来水冲洗后晾干，剥开果壳，将果壳和果仁同时浸入75%酒精30s、3%次氯酸钠2min进行表面消毒，再用无菌水漂洗五次，经灭菌滤纸吸干水分后分别放入灭菌研钵中，加入少许无菌水和灭菌石英砂研磨均匀。各浆液梯度稀释制备菌悬液。取10
‑3、10
‑4、10
‑5梯度的菌悬液100μl涂布na平板，28℃培养箱中培养2～3 d。挑取单个菌落在na平板上划线，28℃下培养24h，重复以上操作，直至得到纯化菌落。分离纯化菌株yj01、菌株 yj02、菌株yj13、菌株yj56。
33.（3）拮抗细菌的筛选预先将白绢病原菌齐整小核菌采用pda培养基平板活化，28℃培养 4 d；将待筛选细菌菌株接种在液体nb 培养基中，28℃、160rpm震荡培养 24 h。超净工作台内用打孔器（d=5 mm）在活化好的齐整小核菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼放入pda培养基平板（d=90 mm）中央，有菌丝的一面朝下。用灭菌枪头在距齐整小核菌菌饼3.5cm 处的四个角点上5 μl菌悬液，每处理3 个重复，设只点液体 nb培养基的齐整小核菌平板为空白对照，28℃下培养5d，待空白对照的齐整小核菌长满整个培养皿时，测量齐整小核菌的对照生长量（点接nb培养液的齐整小核菌落半径）和处理生长量（接种细菌的齐整小核菌落半径），计算抑制率。
34.抑制率( %) = (对照菌落半径
‑
处理菌落半径) /对照菌落半径
×
100。
35.分离出的4 株细菌对齐整小核菌抑制效果如表1所示。
36.表1 四株细菌对齐整小核菌抑制效果。
37.由表1可知，4 株细菌对齐整小核菌抑制率在60%以上，如图1所示以菌株 yj02 的抑制效果最好，抑制率为 83.33%，因此，选取菌株 yj02 作为花生白绢病拮抗菌。
38.（3）生防菌株yj02的鉴定1）菌体形态及培养特征观察及生理生化指标测定将活化后的菌株 yj02划线接种于na固体培养基上，28℃培养 24h，观察菌落颜色和形态，同时挑取适量菌落进行革兰氏染色，生理生化指标测定参考《常见细菌系统鉴定手
册》。
39.菌株yj02在na平板上生长时，初期菌落呈现半透明，培养后期菌落浅黄色，干燥，表面褶皱，边缘不规则。该菌株的生理生化鉴定结果如表2所示。
40.表2 生理生化鉴定注：“+”表示阳性反应，
“‑”
表示阴性反应。
41.由表2可见，菌株yj02为革兰氏阳性菌，厌氧。根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和《常见细菌鉴定手册》，yj02的形态特征和生理生化特征均符合贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）的分类标准。
42.2）分子生物学鉴定提取yj02细菌基因组 dna. 细菌基因组 dna 的提取采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒( 生工生物工程股份有限公司) 试剂盒进行。
43.16s r dna 序列的 pcr 扩增采用通用引物：7f1540r: 5'
‑
cagagtttgatcctggctaggaggtgatccagccgca
‑
3'；27f1492r：5'
‑
agtttgatcmtggctcagggttaccttgttacgactt
‑
3' 。
44.pcr 扩增反应条件: 94 ℃ 1 min；94 ℃ 45s，55℃45s，72 ℃ 1 min，共 30 次循环；72 ℃延伸 10min，4 ℃保存。pcr 扩增产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，以100
‑
3000bp ladder
‑
k为marker，结果如图2所示，送生工生物工程股份有限公司进行纯化与序列测定。
45.采用ncbi 网站上的 basic blast 对所测得的 dna 序列进行同源性比对，并利
用mega 7.0软件采用 n
‑
j 法构建系统发育树，如图3所示。菌株yj02与bacillus velezensis处于进化树中的同一分支，确定为贝莱斯芽孢杆菌。
46.综合上述形态学、生理生化特征以及yj02和相关菌株16s rrna isr 序列同源性分析结果，将yj02菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）。
47.实施例2：菌株 yj02 对 5 种病原真菌的抑菌效果测定通过平板对峙法对镰孢菌 fusarium、炭疽colletotrichumcda、色二孢菌diplodia gossypina、黑曲霉菌aspergillus nige、黄曲霉菌aspergillus flavus 5种真菌进行了抑菌测定，平板对峙操作步骤同实施例1中拮抗细菌的筛选。结果如表3和图4～8所示所示。
48.表3 对 5 种病原真菌的抑菌效果。
49.菌株 yj02对镰孢菌的抑制率为72.5%，对炭疽的抑制率为80.23%，对色二孢菌的抑制率为71.11%，对黑曲霉菌的抑制率为72.09%，对黄曲霉菌的抑制率为65%，对镰孢菌、炭疽、色二孢菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌均有良好的抑制作用。
50.实施例3：菌株yj02 对盆栽花生植株的促生作用测定设接种10 ml贝莱斯芽胞杆菌 yj02菌悬液( 1
×
108cfu
•
ml
‑1) 和清水对照 2个处理，待花生幼苗生长至2～3叶期时分别灌根。每处理 3 次重复，每重复 10 棵幼苗，监测两周。两周后统计地上部分株高、地上部分鲜重和根长、根重等生物学指标以分析菌株的促生效果。结果如表4所示。
51.表4 yj02对盆栽花生植株生长的作用。
52.如图9、10和表4所示，菌株jy02处理的盆栽花生的株高、鲜重、根长和根重均显著高于清水对照组。
53.实施例4：菌株yj02 对花生白绢病的盆栽防效测定设灌根 10 ml 贝莱斯芽胞杆菌yj02菌悬液（1
×
108cfu
•
m l
‑1）、0.24mg/ml噻呋酰胺和清水对照 3个处理，待花生幼苗生长至4～5叶期时分别灌根。供试花生的品种为豫花22号。
54.齐整小核菌的制备: 将齐整小核菌在pda培养基上活化后，将菌饼接种在灭菌棉籽上进行扩繁，备用；生防芽孢杆菌的制备: 在 na平板上活化菌株yj02 后，用接种针挑取单菌落接种于 nb 培养液中，28℃、180 r
•
min
‑1培养 24 h，制成 1
×
108cfu
•
m l
‑1生防菌悬液；待盆栽花生生长至4～5叶期时将接种的棉籽埋入花生植株根部，1天后用生防菌悬液进行灌根处理。每处理 3 次重复，每重复 10 棵花生。待清水处理充分发病后调查统计病情。
55.白绢病发病程度采用0～4级的五级分级标准，具体如下：0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状，整株的1/3以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的1/3～2/3表现系统症状；4级：整株的2/3以上表现系统症状。
56.病情指数=∑(各级病株数
×
相应级别) /( 调查总株数
×
最大级数)
×
100；防治效果(%)=(空白对照病情指数
‑
处理病情指数)/空白对照病情指数
×
100。
57.盆栽防治实验结果如表5所示。
58.表5 菌株yj02对花生白绢病盆栽防治作用。
59.由表5可知，yj02生防菌悬液可防治花生白绢病，防治效果与化学试剂噻呋酰胺的防治效果相当，达到56.41%。
60.实施例5：菌株yj02 对花生白绢病的田间防效测定大田试验设灌根 10 ml 贝莱斯芽胞杆菌 yj02菌悬液(1
×
108cfu
•
m l
‑1) 、0.24mg/ml噻呋酰胺和清水对照 3个处理，于花生封垄期时分别灌根。每组处理 3 次重复，每个重复 20m2。收获前调查统计病情。供试花生的品种为豫花22号。白绢病发病程度采用0～4级的五级分级标准：0级：植株无症状；1级：仅在茎基部产生病斑；2级：茎基部产生缢缩症状,整株的1/3以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；3级：整株的1/3～2/3表现系统症状；4级：整株的2/3以上表现系统症状。
61.病情指数=∑(各级病株数
×
相应级别) /(调查总株数
×
最大级数)
×
100；防治效果(%)=(空白对照病情指数
‑
处理病情指数)/空白对照病情指数
×
100。
62.田间试验结果如表6所示。
63.表6 菌株yj02对花生白绢病大田防治作用处理平均病指平均防效（%）1*108cfu/ml.灌根1次657.141*108cfu/ml.灌根2次5.560.711*108cfu/ml.灌根3次471.42
240g/l噻呋酰胺悬浮剂喷雾3次4.567.86ck14—
64.从中可以看出，yj02生防菌悬液灌根处理对大田花生白绢病的防治效果优良，其中，yj02生防菌悬液灌根处理2次的防治效果与化学试剂噻呋酰胺相当，yj02生防菌悬液灌根处理3次的防治效果高于化学试剂噻呋酰胺，效果最好，表明yj02生防菌悬液在田间表现有很好的防治效果，具有进一步开发为生物农药的潜力。
65.上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。