一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物及应用
技术领域
1.本发明属于分子诊断或检测技术领域，特别涉及一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环新mirna(novel
‑
mirna
‑
1)的鉴定及应用。
背景技术：2.豆状囊尾蚴(cysticercus pisiformis)是豆状带绦虫(t.pisiformis)的幼虫，主要寄生于兔等啮齿类动物的肝脏、腹腔和肠系膜等，导致兔的肝脏严重损伤、炎症、腹水以及生长缓慢或体重减轻，严重者甚至死亡。由于该病感染率高，因此对养兔业造成很大的经济损失。由于没有明显的临床症状，该病通常都是通过剖检发现虫体而确诊，致使检测成本很高，造成不必要的浪费，急需建立一种方便快捷的生前诊断技术。也有血清学诊断方法(dot
‑
elisa)的研究报道，但普遍存在假阳性率高的问题。分子诊断技术具有敏感性和特异性高的特点，但目前仅用于寄生于犬体内的成虫的鉴别诊断。要将分子诊断技术应用于血清样品的检测，必须要有与病原感染相关的特异性诊断标志物。因此，筛选并鉴定与疾病相关的特异性诊断标志物就成了建立血清分子诊断方法的首要任务。
3.鉴于分子诊断技术具有特异性和敏感性高的特点，因此寻找血清中循环的rna/dna作为诊断标志物成为目前研究的热点，而且这方面的研究已在癌症等疾病的诊断中广泛开展。mirna作为一种短的非编码rna，不仅与病原感染、病程以及疾病预后密切相关，而且血清中的循环mirna的水平与病原的感染状态密切相关，且相对稳定。因此，鉴定与豆状囊尾蚴感染密切相关的循环mirna，从而建立基于mirna的分子诊断或检测技术，已成为绦虫蚴病诊断的研究热点。
技术实现要素：4.本发明旨在提供一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环新mirna。同时，本发明提供了基于该mirna的qpcr方法，用于豆状囊尾蚴感染的分子检测。
5.本发明采用以下技术方案：一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物，所述mirna标志物为novel
‑
mir
‑
1，其序列为gcaggugcgaaagcaggua。
6.所述mirna标志物来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调表达，可作为豆状囊尾蚴感染的检测靶标。
7.一种基于与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物的rt
‑
qpcr方法：
8.设计novel
‑
mir
‑
1的特异性引物：tatacgcaggtgcgaaagcagg；以提取的血清mirna为模板，用mir
‑
xtm mirna first
‑
strand synthesis kit合成mirna的cdna第一链；再以novel
‑
mirna
‑
1的特异性引物和通用的mrq 3
′
引物制备如下qpcr反应体系：12.5μl sybr advantage premix(2
×
),2μl cdna,0.5μl rox dye(50
×
),0.5μl novel
‑
mirna
‑
1引物，0.5μl mrq 3
′
引物和9μl无rnase水；反应条件如下：95℃10min，95℃ 15s,60℃ 1min，共40个循环；
9.以u6 snrna作为内参基因，合成引物f:gcttcggcagcacatatactaaaat和r:
cgcttcacgaatttgcgtgtcat，用2
‑
δδct方法计算novel
‑
mirna
‑
1的相对表达水平。
10.一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物应用于豆状囊尾蚴感染的分子检测。
11.有益效果：
12.1、novel
‑
mir
‑
1来源于豆状囊尾蚴，且在豆状囊尾蚴感染的血清中明显上调，可作为其感染的特异性检测靶标；
13.2、在豆状囊尾蚴感染的不同时间点的家兔血清中，novel
‑
mir
‑
1均明显上调表达，保证了检测结果的稳定性。
附图说明
14.图1是novel
‑
mirna
‑
1的前体序列。
15.图2是novel
‑
mirna
‑
1的前体结构。
16.图3是novel
‑
mirna
‑
1的前体序列的rt
‑
pcr图。
17.图4是家兔感染不同时间点novel
‑
mirna
‑
1的rt
‑
qpcr检测图。
具体实施方式
18.本发明公开了一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物：
19.1、分别采集豆状囊尾蚴感染60天的家兔血清，分离mirna进行小rna文库构建和测序分析，筛选在家兔豆状囊尾蚴感染血清中显著差异表达的mirna。
20.2、分析发现了一种新的mirna:novel
‑
mir
‑
1,其序列为gcaggugcgaaagcaggua，其特征在于来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调表达，可作为豆状囊尾蚴感染的检测靶标。
21.3.根据novel
‑
mir
‑
1序列，设计特异性的qpcr引物：tatacgcaggtgcgaaagcagg，用加尾法进行反转录反应，进而通过sybr advantage premix(takara,shiga
‑
ken,japan)进行pcr，建立基于novel
‑
mir
‑
1的rt
‑
qpcr方法。
22.4.利用建立的rt
‑
qpcr方法分别检测豆状囊尾蚴感染2、3、7月后家兔血清中的novel
‑
mirna
‑
1的表达水平，结果表明，与未感染组家兔血清相比，豆状囊尾蚴感染家兔血清中的novel
‑
mirna
‑
1的相对表达量显著升高。说明利用基于novel
‑
mirna的qpcr方法，可以检测家兔豆状囊尾蚴的感染。
23.实施例1
24.一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物，所述mirna标志物为novel
‑
mir
‑
1，其序列为gcaggugcgaaagcaggua。
25.所述mirna标志物来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调表达，可作为豆状囊尾蚴感染的检测靶标。
26.一种基于与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物的rt
‑
qpcr方法：根据novel
‑
mir
‑
1序列，设计特异性的qpcr引物：tatacgcaggtgcgaaagcagg，用加尾法进行反转录反应，进而通过sybr advantage premix进行pcr，建立基于novel
‑
mir
‑
1的rt
‑
qpcr方法。
27.一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环mirna标志物用于豆状囊尾蚴感染的分子检测。
28.实验例
29.1.豆状囊尾蚴感染家兔血清循环mirna分析
30.采集并分离豆状囊尾蚴感染60天的家兔血清和未感染家兔的血清mirna,分别进行小rna文库构建和测序分析，筛选在家兔豆状囊尾蚴感染血清中显著上调表达的mirna。
31.2.鉴定了一个与豆状囊尾蚴感染相关的新mirna(novel
‑
mirna
‑
1)
32.测序数据分析发现，novel
‑
mirna
‑
1在豆状囊尾蚴感染血清中显著上调表达，且其前体序列可比对到豆状囊尾蚴基因组，并通过rt
‑
pcr从豆状囊尾蚴总rna中扩增出其前体序列，说明novel
‑
mirna
‑
1是豆状囊尾蚴特有的mirna，而且可以释放到宿主的血清中，可作为豆状囊尾蚴检测的标志物。
33.3.基于novel
‑
mirna的qpcr方法的建立
34.设计novel
‑
mir
‑
1的特异性引物：tatacgcaggtgcgaaagcagg。以提取的血清mirna为模板，用mir
‑
xtm mirna first
‑
strand synthesis kit(clontech,mountain view,ca,usa)合成mirna的cdna第一链。再以novel
‑
mirna
‑
1的特异性引物和通用的mrq 3
′
引物(takara,shiga
‑
ken,japan)制备如下qpcr反应体系：12.5μl sybr advantage premix(2
×
)(takara,shiga
‑
ken,japan),2μl cdna,0.5μl rox dye(50
×
),0.5μl novel
‑
mirna
‑
1引物，0.5μl mrq 3
′
引物和9μl无rnase水。反应条件如下：95℃10min，95℃ 15s,60℃ 1min，共40个循环。
35.以u6 snrna(small nuclear rna)作为内参基因，其引物(f:gcttcggcagcacatatactaaaat和r:cgcttcacgaatttgcgtgtcat)由上海生工有限公司合成，用2
‑
δδct方法计算novel
‑
mirna
‑
1的相对表达水平。
36.4.豆状囊尾蚴感染不同时间家兔血清循环novel
‑
mirna
‑
1的qpcr检测
37.用上述建立的rt
‑
qpcr方法分别检测豆状囊尾蚴感染2、3、7个月家兔血清中的novel
‑
mirna
‑
1的水平，发现与对照组家兔相比，感染组家兔血清中novel
‑
mirna
‑
1均明显升高。
38.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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