一种β-NGF融合蛋白、其制备方法及用途与流程

本发明属于生物制药领域，具体地，本发明涉及一种β-ngf融合蛋白分子，本发明还涉及所述β-ngf融合蛋白分子的制备方法及用途。

背景技术：

1、神经生长因子(nerve growth factor,ngf)是人类发现的第一个神经营养因子，首先是由意大利神经科学家rita levi-montalcini和美国生物化学家stanley cohen于1956年分离成功；cohen还意外发现了另一种能促进表皮细胞生长、增殖和分化的生长因子，因而将该因子命名为表皮生长因子(epidermal growth factor,egf)。为此，levi-montalcini和cohen于1986年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。

2、神经生长因子(ngf)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元发育、分化、生长、再生和功能特性表达均具有重要调控作用。

3、人ngf基因位于1号染色体短臂2区2带及1号染色体短臂2区1带1号亚带上，由6个外显子及5个内含子组成。

4、ngf最初是在3种蛋白质亚基组成的7s、130kda复合物中，该复合物由α-ngf、β-ngf和γ-ngf(2：1：2比例，图1)三个蛋白组成。这种形式的ngf也称为prongf(ngf前体)。该复合物的α亚单位属于非匀质性酸蛋白，其pi约为4.3，它的作用主要是阻止γ亚单位对β亚单位的水解，从而对其起到保护作用。γ亚单位具有精氨酸酯肽酶活性，其主要作用与ngf的合成有关，可以将无活性的β亚基激活。

5、我们说的神经生长因子通常是指蛋白质的2.5s、26kda的β亚基(即β-ngf)，是生物活性的7s ngf复合物的唯一组分(即充当信号分子)。β-ngf，它是由两条含有118个氨基酸的肽链通过非共价键形成的二聚体。成熟的ngf链内含有6个半胱氨酸残基，可以产生3对链内二硫键，二硫键对维持ngf的生物学活性十分重要，一旦二硫键被破坏，ngf的生物学活性会大大降低甚至是丧失。

6、ngf是一种参与神经元分化和维护的内源性蛋白质，这种内源性蛋白质通过多种机制为眼角膜完整性带来有力的支持。ngf直接作用于角膜细胞来刺激细胞的生长与存活。此外，已知ngf能结合泪腺上的受体(图2)，促进泪液分泌，为眼睛提供润滑和自然保护，免受病原体伤害。这种蛋白质经证实能够支持角膜神经支配，即神经营养性角膜炎当中已经损失的一种神经功能。

7、oxervatetm(cenegermin，重组人神经生长因子，rhngf)是意大利制药商dompé原研的一款滴眼液，是一种用于中度至重度神经营养性角膜炎(neurotrophic keratitis，nk)成人患者的治疗的孤儿药，目前已在欧盟、美国和中国上市。另外，其用于治疗干眼病的适应症在研，二期临床结果良好。但是，每2小时滴眼一次，使用很不方便。

8、鼠神经生长因子已经在中国上市多年，用于治疗外周神经损伤。t1/2(β)为4.83小时，每天注射一次。但鼠神经生长因子有10％氨基酸与人的不一样，有潜在免疫原性的风险。

9、为了制备重组人神经生长因子，原研厂商首先表达prongf包涵体，然后再变复性，纯化prongf复性液，酶切纯化得到重组人神经生长因子。然而，该方法需要酶切，酶切后还需要纯化，步骤较多，过程较为繁琐。这种方法制备的ngf热源不容易去除，半衰期短。

10、中国专利cn108300736b提供了一种cho细胞制备rhngf-fc的方法，但其一个rhngf-fc分子只含有一个ngf活性分子，表达量为18mg/l，况且n端不均一，需要furin酶切。

11、鉴于现有技术中存在的上述问题，本技术的发明人拟开发一种活性好，产量高，半衰期长，n端均一的β-ngf融合蛋白。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种β-ngf融合蛋白分子。该β-ngf融合蛋白分子含有两个β-ngf活性分子，活性好，产量高，半衰期长，n端均一。

2、因此，本发明的第一个目的在于提供一种β-ngf融合蛋白，包含：

3、(a)轻链，所述轻链包含β-ngf；和

4、(b)重链，所述重链包含β-ngf和fc片段。

5、本发明第二个目的在于提供编码所述β-ngf融合蛋白的分离的核酸分子。

6、本发明的第三个目的在于提供含有所述核酸分子的表达载体。

7、本发明的第四个目的在于提供含有所述表达载体的宿主细胞。

8、本发明第五个目的在于提供所述β-ngf融合蛋白的制备方法。

9、本发明第六个目的在于提供含有所述β-ngf融合蛋白的药物组合物。

10、本发明第七个目的在于提供所述β-ngf融合蛋白或所述药物组合物与另外的治疗剂使用。

11、本发明的第八个目的在于提供所述β-ngf融合蛋白或所述药物组合物的用途。

12、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

13、在本发明的第一方面，提供一种β-ngf融合蛋白，包含：

14、(a)轻链，所述轻链包含β-ngf；和

15、(b)重链，所述重链包含β-ngf和fc片段。

16、在另一优选例中，所述β-ngf为人β-ngf。

17、在另一优选例中，所述β-ngf包含如seq id no：1所示的氨基酸序列。

18、在另一优选例中，所述β-ngf和所述fc片段通过连接子连接。

19、在另一优选例中，所述重链从n端到c端依次为β-ngf、连接子和fc片段。

20、在另一优选例中，所述连接子包含通式(ggggs)n，n为整数，n＝1～10；较佳地n＝4～10；优选地n＝4，氨基酸序列如seq id no：3所示。

21、在另一优选例中，所述fc片段来源于igg。

22、在另一优选例中，所述igg来源于哺乳动物；较佳地来源于鼠、食蟹猴或人；优选来源于人。

23、在另一优选例中，所述fc片段选自igg1、igg2、igg3或igg4；较佳地选自igg4。

24、在另一优选例中，所述fc片段包含人igg铰链区、ch2和ch3区。

25、在另一优选例中，所述fc片段包含人igg4铰链区、ch2和ch3区。

26、在另一优选例中，所述fc片段包含如seq id no：2所示氨基酸序列。

27、在另一优选例中，所述fc片段包含fc变体，所述fc变体包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。

28、在另一优选例中，所述重链包含如seq id no：4所示的氨基酸序列。

29、在另一优选例中，所述轻链包含如seq id no：1所示的氨基酸序列。

30、在另一优选例中，所述β-ngf融合蛋白包含如seq id no：4和/或seq id no：1所示的氨基酸序列。

31、在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码如本发明的第一方面所述的β-ngf融合蛋白的核苷酸序列。

32、在另一优选例中，所述核酸分子包含如seq id no：8所示轻链核苷酸序列和如seqid no：9所示重链核苷酸序列。

33、在另一优选例中，所述核酸分子包含如seq id no：11所示轻链核苷酸序列和如seq id no：12所示重链核苷酸序列。

34、在另一优选例中，所述核酸分子包含如seq id no：15所示轻链核苷酸序列和如seq id no：16所示重链核苷酸序列。

35、在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含本发明的第二方面所述的核酸分子。

36、在另一优选例中，所述表达载体为选自pcgs3、pcdna3.4、pdr1、pcdna3.1(+)、pcdna3.1/zeo(+)、pdhfr或ptt5；较佳地选自pcgs3。

37、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的第三方面所述的表达载体。

38、在另一优选例中，所述宿主细胞为选自cos、cho、ns0、sf9、sf21、dh5α、bl21(de3)、tg1、cho-k1、293e或expi293f细胞；较佳地选自cho细胞、293e或expi293f细胞；更佳地为cho细胞。

39、在本发明的第五方面，提供了一种β-ngf融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

40、(a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达β-ngf融合蛋白；

41、(b)分离并纯化步骤(a)所述的β-ngf融合蛋白。

42、在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本发明的第一方面所述的β-ngf融合蛋白和药学上可接受的载体。

43、在本发明的第七方面，提供了如本发明的第一方面所述的β-ngf融合蛋白或本发明第六方面所述的药物组合物，其与另外的治疗剂分别、依次或同时使用。

44、在本发明的第八方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的β-ngf融合蛋白或如本发明的第六方面所述的药物组合物用于制备治疗中度至重度神经营养性角膜炎或者外周神经损伤药物的用途。

45、本发明的第九方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明的第一方面所述的β-ngf融合蛋白，或如本发明的第六方面所述的药物组合物。

46、本发明的有益效果：本发明提供了一种β-ngf融合蛋白分子，该β-ngf融合蛋白分子含有两个β-ngf活性分子，活性好，产量高，半衰期长，n端均一。