增强NK细胞杀伤力的基因靶标及应用的制作方法

增强nk细胞杀伤力的基因靶标及应用
技术领域
1.本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及增强nk细胞杀伤力的基因靶标及应用。


背景技术：

2.nk细胞又称自然杀伤细胞，是机体固有免疫的组成细胞之一，主要分布于外周血和脾脏。在正常情况下，nk细胞通过识别细胞表面的人类白细胞抗原(hla)ⅰ类分子区分“自我”与“非我”以杀伤或诱导凋亡来清除肿瘤细胞或病毒感染细胞。目前，nk细胞已被广泛用于肿瘤的过继免疫治疗中。由于nk细胞仅占外周血淋巴细胞的5％～15％，因而可以通过体外扩增以满足临床治疗的需求。实验研究已表明，体外扩增的nk细胞在肝癌、胶质母细胞瘤、白血病等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤效应。
3.长链非编码rna(lncrna)是一类长度＞200nt但不具备编码蛋白质功能的rna，占到非编码rna的80％。lncrna在细胞生命中发挥重要作用，对细胞各种功能至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供增强nk细胞杀伤力的基因靶标及应用。
5.本发明上述目的通过如下技术方案实现：
6.一种体外增强nk细胞杀伤力的方法，提高nk细胞中靶标基因的表达水平，靶标基因为长链非编码rna。
7.优选地，所述长链非编码rna为lncrna
‑
af289591。
8.nk细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，nk细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放perforin、granzyme b到达靶细胞，perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导granzyme b进入靶细胞，granzyme b进入靶细胞后引发靶细胞的dna断裂使靶细胞凋亡。cd107a也是nk细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测perforin、granzyme b、cd107a的表达水平评价nk细胞的杀伤力强弱。本发明具体实施例说明，高表达lncrna
‑
af289591可以有效提高nk细胞的杀伤力。
9.有益效果：
10.本发明发现，高表达lncrna
‑
af289591可以有效提高nk细胞的杀伤力。
附图说明
11.图1是琼脂糖凝胶电泳测定lncrna
‑
af289591表达水平。
12.图2是流式法检测perforin、granzyme b、cd107a表达水平。
具体实施方式
13.一、实验材料
14.淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司，品牌为multisciences。il
‑
2购自索莱宝，人ab血清购自上海联硕生物科技有限公司，nk细胞培养基品牌为
cellgro。逆转录试剂盒购自takara，lncrna
‑
af289591mimic、nc
‑
mimic及pcr扩增引物购自上海生工。
15.二、实验方法
16.1、nk细胞培养和鉴定
17.取适量抗凝外周血，加入淋巴细胞分离液，2000rpm离心20min，吸取白膜层，生理盐水洗涤3次，去上清，加入添加有200u/ml il
‑
2和50ml/l人ab血清的nk细胞培养基(完全培养基)，调整细胞密度为1
×
106/ml，接种于6孔培养板中，于5％co2、37℃培养箱中培养，根据生长情况及时添加培养基。用percp
‑
cy5.5标记的cd3、fitc标记的cd56与未诱导培养(0d)和培养12d的nk细胞孵育进行流式细胞术检测细胞表型。
18.2、分组和转染
19.取培养12d的nk细胞，制成细胞密度为2
×
106个/ml的细胞悬液，接种到6孔板，每孔2ml，培养24h后进行转染，分别设置lncrna
‑
af289591mimic组、nc
‑
mimic组和空白对照组，转染方式参照lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。
20.3、lncrna
‑
af289591含量水平检测(琼脂糖凝胶电泳法)
21.收集转染后的nk细胞，洗涤，按照trizol试剂盒说明书提取总的rna并测定rna浓度。提取完成后，进行rna浓度测定，保证a260/a280比值大于等于1.8。将获得的rna采用逆转录试剂盒进行逆转录(takara)，逆转录所得的cdna进行pcr扩增，扩增反应完成后，配制1.5％琼脂糖凝胶，取pcr产物各5μl，加入6
×
loading buffer 2μl混合上样，50v电泳60min。利用图像分析系统分析各条带光密度值，拍照。pcr扩增引物序列如下。
22.lncrna
‑
af289591正向：gttgccgtcccatcagttgc(5
’‑3’
)
23.lncrna
‑
af289591反向：tcactcaaggtcaccagcca(5
’‑3’
)
24.gapdh正向：catggcaccgtcaaggctga(5
’‑3’
)
25.gapdh反向：ggactccacgacgtactcag(5
’‑3’
)
26.4、nk细胞杀伤活性检测(流式法)
27.收集转染的nk细胞，pbs洗涤并重悬调整细胞密度为1
×
107/ml，接种于流式管中，每管0.1ml，用pe标记的穿孔素(perforin)、pe标记的颗粒酶b(granzyme b)、apc标记的cd107a孵育进行流式细胞术检测。
28.5、统计学分析
29.使用graphpad prism 5软件进行数据统计学分析。数据采用均数
±
标准差表示，两组数据间比较采用配对t检验，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。
30.三、实验结果
31.1、nk细胞培养和鉴定
32.流式细胞术检测结果显示，0d细胞cd3
－
cd56
+
阳性率为(10.8
±
3.7)％，培养12d的nk细胞cd3
－
cd56
+
阳性率高达(75.2
±
6.5)％，差异有统计学意义，nk细胞培养成功。
33.2、琼脂糖凝胶电泳测定lncrna
‑
af289591表达水平
34.结果如图1所示，与空白对照组和nc
‑
mimic组相比，lncrna
‑
af289591mimic组lncrna
‑
af289591表达水平显著提高，差异有统计学意义，说明高表达lncrna
‑
af289591的nk细胞构建成功。
35.3、流式法检测perforin、granzyme b、cd107a表达水平
36.结果如表1和图2所示，与对照组相比，干预组perforin、granzyme b、cd107a的表达水平均显著上调，差异有统计学意义。
37.表1 perforin、granzyme b、cd107a表达水平
[0038][0039]
nk细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，nk细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放perforin、granzyme b到达靶细胞，perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导granzyme b进入靶细胞，granzyme b进入靶细胞后引发靶细胞的dna断裂使靶细胞凋亡。cd107a也是nk细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测perforin、granzyme b、cd107a的表达水平评价nk细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，高表达lncrna
‑
af289591可以有效提高nk细胞的杀伤力。