使用多重qPCR快速检测并鉴定多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物检测和医学诊断，特别涉及一种使用多重qpcr 快速检测并鉴定多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、肠道重要致病菌主要有金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单细胞增生李斯特菌、致泻大肠埃希氏菌，以及沙门氏菌属、志贺氏菌属、弧菌属、弯曲杆菌属中的多数菌种等。

2、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是临床院内感染最常见且最重要的一种革兰阳性菌，感染后会导致恶心、呕吐、腹泻等症状，特别是会给免疫力低下的人带来严重的健康问题。医院内金黄色葡萄球菌耐药情况也非常严重。

3、艰难梭菌(clostridium difficile)为革兰阳性厌氧杆菌，可产生两种毒素：肠毒素和细胞毒素，导致肠道大量失水和出血性坏死。其引起的抗生素相关性结肠炎，是院内获得性腹泻最常见的原因；15％～25％的抗生素相关性腹泻由艰难梭菌引发。

4、小肠结肠炎耶尔森菌(yersinia enterocolitica)属于肠杆菌科耶尔森菌属，是一种人兽共患的肠道病原菌，是人类耶尔森氏病的主要原因，是全球范围内最重要的食源性病原菌之一。

5、单细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)由于致死率高，在欧盟李氏菌病被认为是最严重的食源性疾病之一。由于宿主对本菌的清除主要依靠细胞免疫功能，因此老年人、孕妇、新生儿及免疫力低下的人群易感。

6、致泻大肠埃希氏菌(escherichia coli)根据致病性的不同主要包括产肠毒素性大肠埃希氏菌(enterotoxigenic e.coli，etec)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive e.coli，eiec)、肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic e.coli，epec)、肠集聚性黏附性大肠埃希氏菌(enteroaggregative e.coli， eaec)和肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic e.coli，ehec)5种。 etec是发达国家旅行者腹泻的主要病原菌之一，也是小儿腹泻的重要病原菌，其发病率仅次于轮状病毒。eiec临床表现类似菌痢，主要侵犯儿童和成人。epec是婴幼儿流行性腹泻的重要病原菌，在医院中常引起暴发流行。 eaec引起的成年人中毒症状表现为中度腹泻，病程1～2天；婴幼儿多表现为2周以上的持续性腹泻。ehec因能引起人类的出血性肠炎而得名，主要致病菌株为o157：h7；人群普遍易感，但以老人儿童为主。

7、沙门氏菌属(salmonella)属于革兰氏阴性肠道杆菌，其多个菌种都是常见的食源性致病菌，如鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium)、肠炎沙门菌 (salmonellaenteritidis)、伤寒沙门菌(salmonella typhi)等。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染的食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国也以沙门氏菌为首位。

8、志贺氏菌属(shigella)的多个菌种均是人类细菌性痢疾的病原菌，如福氏志贺菌(shigella flexneri)、宋内志贺菌(shigella sonnei)、痢疾志贺菌 (shigelladysentery)鲍氏志贺菌(shigella bogdii)。在全球范围内，每年大约有1.647亿痢疾病例，导致110万人死亡。志贺菌属细菌感染长期以来一直是，并将继续是世界范围内重要的公共卫生问题。

9、弧菌属(vibrio)是一类可引起肠道感染的细菌，会引发肠胃炎和霍乱等疾病。弧菌属广泛分布于自然界，尤以水中为多，有100多种。主要致病菌为霍乱弧菌(vibriocholerae)和副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)；前者引起霍乱，后者引起食物中毒。此外，河流弧菌(vibrio fluvialis)溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)也会引起肠道疾病。

10、弯曲杆菌属(campylobacter)的多个菌种是引起人类细菌性胃肠炎的一个最主要致病因素，在美国每年有130多万感染病例。在人类疾病中最经常报告发生的为空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)和大肠弯曲菌 (campylobacter coli)。诸如海欧弯曲杆菌(campylobacter lari)和乌普萨拉弯曲杆菌(campylobacter upsaliensis)等其它菌种也从腹泻病人身上分离出来，但是报告出现的频次较少。

11、传统的基于细菌培养、分离及生化鉴定的检测方法步骤繁琐、费时费力，且通常需要几天才能获得结果，不能达到快速诊断的目的。基于免疫学的酶联免疫吸附测定(elisa)与传统的培养方法相比更简单、快速，但其灵敏度低，且容易发生非特异性的交叉反应。基于分子生物学的方法也被广泛应用于各种病原菌的检测。dna微阵列可以同时检测多种病原体，但是成本非常高。环介导等温扩增(lamp)是一种简单、快速、低成本的等温扩增方法，在资源有限的地区非常有用。但它也有缺点，首先，单个靶序列的检测所需引物多于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)，因此设计难度大，且难以实现多重扩增；其次，lamp的检测灵敏度也低于pcr。pcr方法简单、快速、灵敏度高、特异性强。在常规pcr中引入特异性荧光探针升级而成的实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)技术进一步提升了灵敏度和特异性，并且由于不需要后续的凝胶电泳步骤也大大降低了交叉污染和检测结果与样本错配的可能性。此外，多重pcr作为最重要的pcr 衍生技术之一，可以在一个反应体系中同时扩增多个片段，与单重反应相比又增加了一个检测通量大的优势。但是由于单管反应中多个pcr反应之间的相互干扰和竞争，多重pcr对反应体系和反应条件的要求大大高于单重pcr，其设计与开发难度随着单管反应中所包含的pcr反应个数的增加呈指数增长。而发明人团队所拥有的基于核酸热力学理论的核心技术正是解决这一难题的有效手段。该技术是一个融合物理、化学、计算机和生物医学的跨学科理论分析方法，利用计算机算法模拟溶液中多重核酸的杂交来完成引物、探针及反应条件的设计，可以在最大限度保证多重pcr反应的高灵敏度和高特异性的前提下显著增加单管反应中的pcr反应个数。

12、现也有使用多重pcr检测肠道致病菌的方法，但是都存在一定的缺陷。专利“11种肠道致病菌核酸多重pcr检测试剂盒及其应用”(cn105525031 a) 及专利“一种多重pcr肠道致病菌检测引物组、试剂盒”(cn 104531898 a) 均是使用普通多重pcr结合基于毛细管电泳技术对扩增产物进行检测，操作步骤复杂，实际应用中存在缺陷。专利“致泻性大肠杆菌检测试剂盒及其检测分型方法”(cn 103215358 a)以及专利“致泻大肠杆菌四重荧光定量pcr检测试剂盒”(cn 102399884 a)采用qpcr的方法，但只是对致泻大肠埃希菌的检测，对肠道病原菌覆盖少。

13、因此有必要提供一种更可靠的方案来实现多肠道病原菌的多重qpcr检测方案，以适应临床的需求。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种使用多重qpcr快速检测并鉴定多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法。本发明可以在6管qpcr反应中同时检测和鉴定常见的5个致病菌种和4个致病菌属的19个毒力基因或种属特异性基因。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种使用多重qpcr快速检测并鉴定多种肠道致病菌的组合物，其检测的靶基因包括：

3、金黄色葡萄球菌的nuc基因，艰难梭菌的tpi基因，小肠结肠炎耶尔森菌的lysp基因，单增李斯特菌的hly4基因，志贺菌属的ipah基因，沙门菌属的inva基因，弧菌属的dnaj基因，弯曲杆菌属的cadf基因，epec的eae 和escv基因，ehec的stx1和stx2基因，etec的lt、sth和stp基因，eaec 的aggr、asta和pic基因以及eiec的inve基因；

4、该组合物包括：

5、用于检测沙门菌属的inv4基因的正向引物：seq id no.1，探针：seq id no.2或seq id no.3，反向引物：seq id no.4或seq id no.5；

6、用于检测弧菌属的dnaj基因的正向引物：seq id no.6或seq id no.7，探针：seqid no.8、seq id no.9或seq id no.10，反向引物：seq id no. 11或seq id no.12；

7、用于检测弯曲杆菌属的cadf基因的正向引物：seq id no.13或seq id no.14，探针：seq id no.15或seq id no.16，反向引物：seq id no.17 或seq id no.18；

8、用于检测eaec的aggr基因的正向引物：seq id no.19或seq id no. 20，探针：seqid no.21或seq id no.22，反向引物：seq id no.23、seq id no.24或seq id no.25；

9、用于检测eaec的asta基因的正向引物：seq id no.26或seq id no.27，探针：seqid no.28或seq id no.29，反向引物：seq id no.30或seq id no.31；

10、用于检测eaec的pic基因的正向引物：seq id no.32或seq id no.33，探针：seqid no.34或seq id no.35，反向引物：seq id no.36或seq id no.37；

11、用于检测艰难梭菌的tpi基因的正向引物：seq id no.38或seq id no. 39，探针：seq id no.40或seq id no.41，反向引物：seq id no.42；

12、用于检测单增李斯特菌的hlya基因的正向引物：seq id no.43或seq id no.44，探针：seq id no.45或seq id no.46，反向引物：seq id no.47、 seq id no.48或seq idno.49；

13、用于检测epec和ehec的escv基因的正向引物：seq id no.50或seq id no.51，探针：seq id no.52或seq id no.53，反向引物：seq id no.54 或seq id no.55；

14、用于检测epec和ehec的eae基因的正向引物：seq id no.56或seq id no.57，探针：seq id no.58，反向引物：seq id no.59或seq id no.60；

15、用于检测ehec的stx1基因的正向引物：seq id no.61，探针：seq id no.62或seqid no.63，反向引物：seq id no.64或seq id no.65；

16、用于检测ehec的stx2基因的正向引物：seq id no.66或seq id no.67，探针：seqid no.68或seq id no.69，反向引物：seq id no.70或seq id no.71；

17、用于检测eiec的inve基因的正向引物：seq id no.72或seq id no.73，探针：seqid no.74或seq id no.75，反向引物：seq id no.76或seq id no.77；

18、用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的lysp基因的正向引物：seq id no.78 或seq idno.79，探针：seq id no.80或seq id no.81，反向引物：seq id no.82或seq id no.83；

19、用于检测志贺菌属和eiec的ipah基因的正向引物：seq id no.84、seq idno.85或seq idno.86，探针：seq idno.87、seq idno.88或seq id no.89，反向引物：seq id no.90、seq id no.91或seq id no.92；

20、用于检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的正向引物：seq id no.93或seq id no.94，探针：seq id no.95或seq id no.96，反向引物：seq id no.97 或seq id no.98；

21、用于检测etec的lt基因的正向引物：seq id no.99或seq id no.100，探针：seqid no.101或seq id no.102，反向引物：seq id no.103；

22、用于检测etec的sth基因的正向引物：seq id no.104、seq id no.105 或seq idno.106，探针：seq id no.107、seq id no.108或seq id no.109，反向引物：seq id no.110或seq id no.111；

23、用于检测etec的stp基因的正向引物：seq id no.112或seq id no. 113，探针：seq id no.114，反向引物：seq id no.115或seq id no.116。

24、优选的是，所有探针序列的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，探针在完好状态下其淬灭基团可以淬灭荧光基团发出的荧光信号，因而实时荧光定量pcr仪检测不到荧光信号；在每一个pcr循环过程中，dna聚合酶降解探针，使得淬灭基团与荧光基团分离，因此荧光恢复，荧光基团发出荧光信号，实时荧光定量pcr仪通过检测荧光信号的强度可以对未知样品进行定量分析。

25、优选的是，该组合物包括：

26、用于检测沙门菌属的inva基因的正向引物：seq id no.1，探针：seq id no.2，反向引物：seq id no.4；

27、用于检测弧菌属的dnaj基因的正向引物：seq id no.7，探针：seq id no.10，反向引物：seq id no.11；

28、用于检测弯曲杆菌属的cadf基因的正向引物：seq id no.13，探针： seq idno.15，反向引物：seq id no.18；

29、用于检测eaec的aggr基因的正向引物：seq id no.20，探针：seq id no.21，反向引物：seq id no.23；

30、用于检测eaec的asta基因的正向引物：seq id no.27，探针：seq id no.28，反向引物：seq id no.31；

31、用于检测eaec的pic基因的正向引物：seq id no.32，探针：seq id no. 34，反向引物：seq id no.36；

32、用于检测艰难梭菌的tpi基因的正向引物：seq id no.39，探针：seq id no.41，反向引物：seq id no.42；

33、用于检测单增李斯特菌的hlya基因的正向引物：seq id no.43，探针： seq idno.46，反向引物：seq id no.49；

34、用于检测epec和ehec的escv基因的正向引物：seq id no.50，探针： seq idno.53，反向引物：seq id no.54；

35、用于检测epec和ehec的eae基因的正向引物：seq id no.56，探针： seq idno.58，反向引物：seq id no.59；

36、用于检测ehec的stx1基因的正向引物：seq id no.61，探针：seq id no.62，反向引物：seq id no.64；

37、用于检测ehec的stx2基因的正向引物：seq id no.66，探针：seq id no.68，反向引物：seq id no.70；

38、用于检测eiec的inve基因的正向引物：seq id no.72，探针：seq id no.74，反向引物：seq id no.76；

39、用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的lysp基因的正向引物：seq id no.78，探针：seqid no.80，反向引物：seq id no.82；

40、用于检测志贺菌属和eiec的ipah基因的正向引物：seq id no.84，探针：seq idno.87，反向引物：seq id no.91；

41、用于检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的正向引物：seq id no.93，探针： seq idno.95，反向引物：seq id no.97；

42、用于检测etec的lt基因的正向引物：seq id no.99，探针：seq id no. 101，反向引物：seq id no.103；

43、用于检测etec的sth基因的正向引物：seq id no.104，探针：seq id no.108，反向引物：seq id no.111；

44、用于检测etec的stp基因的正向引物：seq id no.112，探针：seq id no.114，反向引物：seq id no.115。

45、优选的是，该组合物包括：

46、用于检测沙门菌属的inva基因的正向引物：seq id no.1，探针：seq id no.3，反向引物：seq id no.4；

47、用于检测弧菌属的dnaj基因的正向引物：seq id no.6，探针：seq id no.10，反向引物：seq id no.11；

48、用于检测弯曲杆菌属的cadf基因的正向引物：seq id no.14，探针： seq idno.15，反向引物：seq id no.17；

49、用于检测eaec的aggr基因的正向引物：seq id no.19，探针：seq id no.22，反向引物：seq id no.24；

50、用于检测eaec的asta基因的正向引物：seq id no.26，探针：seq id no.28，反向引物：seq id no.30；

51、用于检测eaec的pic基因的正向引物：seq id no.33，探针：seq id no. 35，反向引物：seq id no.37；

52、用于检测艰难梭菌的tpi基因的正向引物：seq id no.38，探针：seq id no.41，反向引物：seq id no.42；

53、用于检测单增李斯特菌的hlya基因的正向引物：seq id no.43，探针： seq idno.45，反向引物：seq id no.49；

54、用于检测epec和ehec的escv基因的正向引物：seq id no.51，探针： seq idno.52，反向引物：seq id no.55；

55、用于检测epec和ehec的eae基因的正向引物：seq id no.57，探针： seq idno.58，反向引物：seq id no.59；

56、用于检测ehec的stx1基因的正向引物：seq id no.61，探针：seq id no.62，反向引物：seq id no.65；

57、用于检测ehec的stx2基因的正向引物：seq id no.67，探针：seq id no.69，反向引物：seq id no.70；

58、用于检测eiec的inve基因的正向引物：seq id no.73，探针：seq id no.75，反向引物：seq id no.77；

59、用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的lysp基因的正向引物：seq id no.79，探针：seqid no.81，反向引物：seq id no.83；

60、用于检测志贺菌属和eiec的ipah基因的正向引物：seq id no.85，探针：seq idno.89，反向引物：seq id no.91；

61、用于检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的正向引物：seq id no.94，探针： seq idno.96，反向引物：seq id no.97；

62、用于检测etec的lt基因的正向引物：seq id no.100，探针：seq id no. 101，反向引物：seq id no.103；

63、用于检测etec的sth基因的正向引物：seq id no.106，探针：seq id no.109，反向引物：seq id no.110；

64、用于检测etec的stp基因的正向引物：seq id no.113，探针：seq id no.114，反向引物：seq id no.115。

65、优选的是，该组合物包括：

66、用于检测沙门菌属的inva基因的正向引物：seq id no.1，探针：seq id no.2，反向引物：seq id no.5；

67、用于检测弧菌属的dnaj基因的正向引物：seq id no.7，探针：seq id no.8，反向引物：seq id no.12；

68、用于检测弯曲杆菌属的cadf基因的正向引物：seq id no.13，探针： seq idno.16，反向引物：seq id no.18；

69、用于检测eaec的aggr基因的正向引物：seq id no.20，探针：seq id no.22，反向引物：seq id no.24；

70、用于检测eaec的asta基因的正向引物：seq id no.26，探针：seq id no.29，反向引物：seq id no.31；

71、用于检测eaec的pic基因的正向引物：seq id no.32，探针：seq id no. 34，反向引物：seq id no.37；

72、用于检测艰难梭菌的tpi基因的正向引物：seq id no.38，探针：seq id no.40，反向引物：seq id no.42；

73、用于检测单增李斯特菌的hlya基因的正向引物：seq id no.44，探针： seq idno.46，反向引物：seq id no.48；

74、用于检测epec和ehec的escv基因的正向引物：seq id no.51，探针：seq idno.52，反向引物：seq id no.55；

75、用于检测epec和ehec的eae基因的正向引物：seq id no.56，探针：seq id no.58，反向引物：seq id no.60；

76、用于检测ehec的stx1基因的正向引物：seq id no.61，探针：seq id no.63，反向引物：seq id no.64；

77、用于检测ehec的stx2基因的正向引物：seq id no.66，探针：seq id no.69，反向引物：seq id no.71；

78、用于检测eiec的inve基因的正向引物：seq id no.73，探针：seq id no.75，反向引物：seq id no.77；

79、用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的lysp基因的正向引物：seq id no.78，探针：seqid no.81，反向引物：seq id no.82；

80、用于检测志贺菌属和eiec的ipah基因的正向引物：seq id no.86，探针：seq idno.87，反向引物：seq id no.90；

81、用于检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的正向引物：seq id no.93，探针： seq idno.95或seq id no.96，反向引物：seq id no.98；

82、用于检测etec的lt基因的正向引物：seq id no.99，探针：seq id no. 102，反向引物：seq id no.103；

83、用于检测etec的sth基因的正向引物：seq idno.105，探针：seq id no.109，反向引物：seq id no.110；

84、用于检测etec的stp基因的正向引物：seq idno.112，探针：seq id no.114，反向引物：seq id no.116。

85、本发明还提供一种使用多重qpcr快速检测并鉴定多种肠道致病菌的试剂盒，该试剂盒中的pcr反应体系包括权利要求1-5中任意一项所述的组合物。

86、优选的是，该试剂盒的使用方法为：

87、1)将pcr反应体系分为6管，在每一管pcr反应体系中加入了一个内质控反应iac；

88、2)把基因inva、dnaj和cadf的引物、探针分为管1，用于沙门菌属、弧菌属和弯曲杆菌属的鉴定；

89、把基因aggr、asta和pic的引物、探针分为管2，用于eaec毒力基因的鉴定；

90、把基因tpi、hlya和escv的引物、探针分为管3，用于艰难梭菌、单增李斯特菌和epec或ehec的鉴定；

91、把eae、stx1、stx2和inve的引物、探针分为管4，用于鉴定eiec、epec 或ehec；

92、把基因lysp、ipah和nuc的引物、探针分为管5，用于小肠结肠炎耶尔森菌、志贺菌属、金黄色葡萄球菌的鉴定；

93、把基因lt、sth和stp分为管6，用于etec毒力基因的鉴定；

94、3)将样品分别加入6管中进行荧光定量pcr反应；

95、4)首先判断iac是否有荧光信号，若有，则认为pcr反应扩增正常，此时，通过检测荧光信号判断出样本中含有的菌种或菌属；若iac没有荧光信号，则判定实验失败，检测结果为假阴性。

96、优选的是，其中，内质控反应iac引物探针序列包括：

97、正向引物seq id no.117、反向引物seq id no.118和探针seq id no. 119。

98、优选的是，所述pcr反应体系还包括去离子水、无mg2+离子pcr缓冲液、taq聚合酶、4种dntp的混合液、mgcl2溶液。

99、优选的是，所述步骤3)中荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性15 min，1个循环；95℃变性8s，55℃退火30s，70℃延伸15s，共45个循环； 4℃降温30s，1个循环。

100、本发明的有益效果是：

101、1、本发明可一次性鉴定出4个菌属和5个菌种的肠道重要致病菌的共 19个靶基因，肠道重要致病菌覆盖广，检测通量大、时间短，且不需要细菌培养，适合突发腹泻疫情的应急检测；

102、2、本发明的反应体系中加入了iac内质控反应，可以有效预防假阴性结果；

103、3、本发明利用qpcr方法检测的特异性好，灵敏度高，操作简便，结果也易于判读。