一种侧链酯化抗菌肽wlc6及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种侧链酯化抗菌肽wlc6及其制备方法和应用。
背景技术：2.自从1929年弗莱明发现青霉素以来，越来越多的抗生素被广泛应用于医药卫生、食品安全和畜牧生产等多个领域。随着抗生素的大量使用甚至是滥用，人类对抗生素的不规范使用最终会导致耐药菌株的不断出现。尤其是新德里金属-β-内酰胺酶(ndm-1)和多重耐药性鲍曼不动杆菌(mrab)的出现，使全世界面临进入“后抗生素时代”的阶段。目前很多国家已经意识到这个问题的严重性，纷纷开始出台各种政策法规限制抗生素的使用。因此，目前寻找一种高效抗菌、低毒性、无残留和无污染的抗菌药物成了各国科研人员研究的焦点和重点。
3.抗菌肽(antimicrobial peptides,amps)是一类具有广谱抗菌活性、结构多样性的短肽，在脊椎动物中，许多抗菌肽可以为机体提供保护，并在先天免疫系统中起调节作用。与抗生素通常作用于少数特定靶点的作用机理不同，大部分抗菌肽通过物理性吸附并迅速渗透和破坏细菌膜的基本成分来杀死细菌。抗菌肽还可作用于微生物生物合成过程，如dna、蛋白质、细胞壁合成和蛋白质折叠等来发挥抗菌效果。
4.目前，三千多种天然抗菌肽已经在动物、植物和微生物中被广泛提取分离鉴定。但天然抗菌肽通常在机体内含量甚微，其分离提纯难度很大。并且天然抗菌肽在生物体内通常起免疫调节的作用，其还面临着直接的生物学活性低，毒性大，稳定性低等缺点，很难直接作为专一的抗生素直接应用于临床。所以利用生物工程手段全新设计具有高效抗菌活性，低毒性和高稳定性的抗菌肽成为一条有效途径，在丰富抗菌肽家族的同时，也为新型抗菌肽制剂研制和开发开辟新道路。
技术实现要素：5.基于以上不足之处，本发明提供一种侧链酯化抗菌肽wlc6，解决天然抗菌肽活性低、毒性高、稳定性差等问题。
6.本发明所采用的技术方案如下：一种侧链酯化抗菌肽wlc6，序列如下：wlkklkkk(c6)lkklk(c6)kk，其中c6为正己烷酸，其对第8位置和第13位置的lys侧链进行正己烷酸脂酰化修饰。
7.本发明的另一目的是提供一种侧链酯化抗菌肽wlc6的制备方法，如下：利用标准α螺旋七肽重复序列“abcdefg”，其中“a”和“d”位置为疏水性氨基酸，其它位置为亲水性氨基酸为基础，采用leu和lys设计出基础序列wlkklkkklkklkkk，进一步的根据α螺旋结构对七肽重复序列第8位置和第13位置的lys侧链进行正己烷酸脂酰化修饰，增加螺旋分子之间的相互作用，设计出新型侧链酯化抗菌肽wlc6，其序列如下：wlkklkkk(c6)lkklk(c6)kk。
8.本发明的另一目的在于提供如上所述的一种侧链酯化抗菌肽wlc6在治疗革兰氏
阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。
9.进一步的，如上所述的革兰氏阴性菌为多重耐药大肠杆菌e.coli hzp73、e.coli hzp74和e.coli clnp19。
10.进一步的，如上所述的革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
11.本发明具有如下优点及有益效果：对得到的抗菌肽wlc6进行抗菌活性、溶血活性和盐离子稳定性检测，发现侧链酯化抗菌肽wlc6不但对大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等标准菌株有明显的抑制作用，而且对临床分离的多重耐药大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)有高效的抑制作用，同时在检测范围内没有检出明显的溶血毒性。并且该侧链酯化抗菌肽wlc6在150mm nacl，4.5mm kcl，1mm mgcl2、8μm zncl2、6μm nh4cl、2mm cacl2和3μm fecl3盐离子存在下仍然保持高效的抗菌活性，具有较高的盐粒子稳定性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到36.30。综合来看，侧链酯化抗菌肽wlc6是一种具有较高实际应用潜力的抗菌肽。
附图说明
12.图1为侧链酯化抗菌肽wlc6的液相图。
13.图2为侧链酯化抗菌肽wlc6的质谱图。
14.图3为侧链酯化抗菌肽wlc6的作用机制透射电镜图。
具体实施方式
15.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
16.实施例1
17.抗菌肽的设计
18.侧链酯化抗菌肽wlc6的氨基酸序列为：
[0019][0020]
利用标准α螺旋七肽重复序列“abcdefg”(其中“a”和“d”位置为疏水性氨基酸，其它位置为亲水性氨基酸)为基础，利用leu和lys设计出基础序列trp leu lys lys leu lys lys lys leu lys lys leu lys lys lys。进一步的根据α螺旋结构对七肽重复序列第8位置和第13位置的lys侧链进行正己烷酸脂酰化修饰，增加螺旋分子之间的相互作用，设计出新型侧链酯化抗菌肽wlc6。其序列如序列表1所示。
[0021]
表1 侧链酯化抗菌肽wlc6的主要参数
[0022][0023]
wlc6的分子式结构：
[0024][0025]
wlc6的序列长度为15个氨基酸，净电荷数为+8。用两个正己烷酸扩大了抗菌肽的疏水面，提高了两个wlc6分子之间的相互作用，提高了肽的活性和稳定性。
[0026]
实施例2
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将上述序列的抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：
[0028]
1、抗菌肽的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将fmoc-x(x是每个抗菌肽的c端第一个氨基酸)接入到wang树脂，然后脱去fmoc基团后得到x-wang树脂；再将fmoc-y-trt-oh(9-芴甲氧羧基-三甲基-y，y为每个抗菌肽c端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从c端合成到n端，直至合成完毕，得到脱去fmoc基团的侧链保护的树脂；
[0029]
2、使用水合肼脱去fmoc-lys(dde)-oh侧链dde保护基团，重复步骤1，完成第8位置和第13位置正己烷酸的键合。
[0030]
3、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光反应2小时，过滤；沉淀tfa(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由tfa、水和tis(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
[0031]
4、使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
[0032]
5、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图2)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
[0033]
实施例3
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抗菌肽生物学活性的测定
[0035]
对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌活性、溶血活性以及盐离子稳定性的能力进行检测；
[0036]
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。挑取细菌及临床分离的耐药菌单菌落在mhb培养基中培养过夜，并转移至新的mhb中生长到对数中期。然后将上述细菌及临床分离的耐药菌溶液离心并重悬于mhb中至终浓度为1
×
105cfuml-1
，并将其转移到96孔板中，每孔50μl。将50μl含有不同浓度肽的bsa(ph＝6.0)分别加入到上述的96孔板中，96孔板中的最终肽浓度范围为0.125至64μm。在37℃温育22-24
小时后，用酶标仪在492nm(od＝492nm)处测定光吸收值,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
[0037]
表2 侧链酯化抗菌肽wlc6的抑菌活性(μm)
[0038][0039]
通过表2可以看出，侧链酯化抗菌肽wlc6对于革兰氏阴性、革兰氏阳性菌及多重耐药菌均表现出显著的抑菌活性。
[0040]
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1ml，肝素抗凝后溶解到2ml pbs溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用pbs洗涤3遍，再用10ml pbs(ph＝6.0)重悬；取50μl红细胞悬液与50μl用pbs溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μl pbs作为阴性对照；50μl红细胞加50μl 0.1％tritonx-100作为阳性对照。溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度检测结果见表3。通过表3可以看出，侧链酯化抗菌肽wlc6在检测范围内没有溶血活性.
[0041]
表3 侧链酯化抗菌肽wlc6血活性的测定
[0042][0043]
侧链酯化抗菌肽wlc6在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到36.30。
[0044]
3、稳定性的测定：将每种浓度(300mm nacl，9mm kcl，2mm mgcl2、16μm zncl2、12μm nh4cl、4mm cacl2和6μm fecl3)的盐粉末溶解在bsa溶液中，后续步骤与抗菌活性的测定方法一致。检测结果见表4。
[0045]
表4 侧链酯化抗菌肽wlc6在生理盐浓度条件下对大肠杆菌25922的抑菌活性(μm)
[0046][0047]
根据实验结果可以看出，侧链酯化抗菌肽wlc6在生理浓度的盐粒子水平下依旧保持着良好的抑菌活性。
[0048]
4、作用机制检测：利用高分辨透射电子显微镜(tem)对侧链酯化抗菌肽wlc6的作用机制进行探究。(1)菌液准备：大肠杆菌atcc25922按照测试1中方法准备，用pbs冲洗菌体3遍，重悬细菌至pbs并调浑浊度值至od
600nm
＝0.35；(2)样品处理：将准备好的细菌悬浮液添加1倍mic浓度的目标肽，37℃孵育60min。(3)样品固定：将孵育完成后的细菌悬浮液在5000g下离心5min，收集菌体，无菌pbs冲洗3遍。加0.65ml ph＝7.4的2.5％戊二醛，充分摇匀4℃固定过夜；(4)观察：将固定后的样品通过tem观察拍照。结果如图3所示，侧链酯化抗菌肽wlc6通过直接的物理性膜破坏，导致细菌内容物泄露杀死细菌。
[0049]
综合以上结果显示，侧链酯化抗菌肽wlc6具有较高的治疗指数和生物学功能稳定性，表明其具有较强的替代抗生素治疗包括多重耐药菌在内的细菌感染的潜力。