一种强化生物基戊二胺合成的方法

本发明属于生物，具体而言，本发明涉及一种强化生物基1,5-戊二胺合成的方法及其应用。

背景技术：

1、尼龙聚酰胺(pas)是一类具有良好的机械性能、耐热性、耐腐蚀性等性质的工程塑料，其中pa66应用最为常见。pa66由等比例的己二酸和己二胺缩聚得到，在纺织、涂料和化妆等行业的需求量大。目前pa66的关键生产原料己二胺主要由化学合成得到，对石油等化石燃料的依赖度极高；另外，由己二腈化学合成己二胺的重要生产技术一直被国外企业所垄断，严重制约我国尼龙行业的发展。

2、生物基尼龙pa5x因为具有良好的类似特性和可持续的生产方式而备受关注。由戊二胺和二元酸可以合成一系列的尼龙pa5x产品，生物基尼龙pa5x 的生产不仅能够降低尼龙行业对石油资源的依存度，而且能够形成具有自主知识产权的尼龙pa5x生产技术，实现国内聚酰胺工业生产的重大突破。

3、生物基尼龙pa5x的关键是核心单体戊二胺的高效合成。生物基戊二胺的生产主要依赖于赖氨酸脱羧酶。在高浓度戊二胺的生产过程中，反应体系的ph 会随着产物戊二胺的不断累积而明显升高，而目前所报道的大多数赖氨酸脱羧酶的最适ph在酸性或中性条件下，当ph为8.0时，其催化活性几乎完全丧失。因此强化赖氨酸脱羧酶的耐碱性，是目前生物基戊二胺生产的一个关键。

4、酶的活性和稳定性在很大程度上受到反应离子环境影响，反应离子环境的改变能够导致蛋白质表面局部溶剂与溶剂主体的差异，影响酶活性位点甚至改变酶的整体结构。lee等发现na+能够影响蛋白质表面水分子的氢键，影响局部溶剂浓度(the effect ofhofmeister anions on water structure at protein surfaces)。 granjon等发现na+环境中能够影响β-亚基色氨酸，进而改变草酰乙酸脱羧酶的二级结构(structure-functionrelations in oxaloacetate decarboxylase complex. fluorescence and infraredapproaches to monitor oxomalonate and na+binding effect)。lorencova等发现一定浓度的nacl能够提高脱羧酶的活性，提高生物胺的产量(selected factors influencingthe ability of bifidobacterium to form biogenic amines)。本发明中通过添加一定量的无机盐，改变反应体系微环境，提高了赖氨酸脱羧酶的反应ph和耐碱性。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于提供一种强化生物基戊二胺合成的方法，其特征在于，通过向反应体系中添加一定量的无机盐，改变反应微环境，进而提高生物基戊二胺合成所必须的赖氨酸脱羧酶的催化效率和耐碱性，从而强化其参与的合成生物基戊二胺过程。所述的强化生物基戊二胺合成的方法，具体而言包括如下步骤：

2、将赖氨酸脱羧酶与底物l-赖氨酸盐酸盐和辅酶磷酸吡哆醛(plp)混合，并添加一定量的无机盐于反应体系中，离心后收集上清液得到包含戊二胺的反应溶液。

3、在本发明方法中，所述的无机盐的阳离子是na+、k+、mg2+、ca2+、zn2+、 fe2+、fe3+、nh4+一种或者几种，所述的无机盐阴离子是阴离子cl-、ch3coo-、 co32-、hco3-、hpo42-、h2po4-一种或者几种。

4、优选地，无机盐阳离子为na+和/或k+。

5、优选地，无机盐阴离子为cl-和/或ch3coo-。

6、所述的无机盐的添加量为0.01～10％(w/v)，优选地无机盐添加量为0.1～2.7％(w/v)，更优选地无机盐添加量为0.3～1.8％(w/v)，更加优选地无机盐添加量为0.9～1.8％(w/v)，例如可以是0.9％、1.0％、1.2％、1.35％、1.5％、 1.8％等。

7、所述的无机盐的添加时机可以在赖氨酸脱羧酶添加之前加入，也可以在赖氨酸脱羧酶添加之后加入。

8、在本发明方法中，所述的赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌、蜂房哈夫尼菌、耐碱芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、尸杆菌、伯克霍尔德氏菌、青紫色素杆菌、霍乱弧菌、毛链霉菌、反刍动物月形单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、沙雷氏菌属、博代氏杆菌属、霍乱弧菌、气单胞菌属或克雷伯氏菌属中的任意一种；

9、优选地，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌、克雷伯氏菌属、气单胞菌属或邦戈沙门氏菌。

10、优选地，所述的赖氨酸脱羧酶的存在形式是游离的、固定化的或者是包含于细胞之内的。

11、优选地，包含赖氨酸脱羧酶的细胞是新鲜的或者冻存的。

12、在本发明方法中所述的反应体系的环境是缓冲液或新鲜发酵液。

13、优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种，优选地，缓冲液为tris-hcl缓冲液或磷酸缓冲液。

14、优选地，所述反应体系的ph为5～11，例如可以是5、6、6.4、7、7.2、7.5、 8、9、10或11等，优选为6～10。

15、在本发明方法中所述反应体系中底物l-赖氨酸盐酸盐的浓度为0.01～3m，例如可以是0.01m、0.1m、0.5m、0.8m、1m、1.2m、1.5m、1.8m、2m、 2.5m、3m。

16、所述反应体系中辅酶plp的浓度为0.1～0.5mm，例如可以是0.1mm、0.15 mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm或0.5mm等。

17、在本发明方法中所述生物基戊二胺合成的反应的温度为35～65℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃等，时间为0.5～24h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、 16h、18h、20h或24h等，优选为1～4h。

18、所述反应时振荡速率为100～800rpm，优选地，反应时的振荡速率为200～800rpm，例如可以是200rpm、250rpm、400rpm、500rpm、550rpm、600rpm、 650rpm、700rpm或800rpm等。

19、本发明方法中所述的离心收集上清液时的离心转速为6000～12000rpm，优选地，离心时的转速为10000～12000rpm，例如可以是10000rpm、10500rpm、 11000rpm、11500rpm或12000rpm等，时间为1～30min，例如可以是1min、 2min、5min、10min、20min、30min等。

20、优选地，所述制备戊二胺的方法包括如下步骤：

21、(1)将游离的赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛的反应体系混合，所述的反应体系中的赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.01～3m，磷酸吡哆醛的摩尔浓度为0.1～0.5mm。

22、(2)添加0.9～1.8％(w/v)的nacl、kcl、ch3coona和/或ch3cook 于反应体系中，所述反应体系的ph为6～10；

23、(3)在35～65℃下以200～800rpm振荡反应1～4h，再以10000～12000rpm 离心1～30min，得到包含戊二胺反应溶液。

24、本发明中，在合成戊二胺后，检测赖氨酸和戊二胺采用的方法为：

25、(1)在衍生体系中加入600μl 50mm ph 9的硼酸缓冲液、200μl甲醇、60μl稀释样品、130μl ddh2o和10μl 1m乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯 (deemm)，室温下放置反应10min，转移至60～80℃水浴1～2h，终止反应；

26、(2)使用反相高效液相色谱紫外检测器进行检测，流动相a为100％的乙腈；流动相b为25mm ph 4.8醋酸钠缓冲溶液，流速0.5ml/min；检测柱为 c18；柱检测温度：35℃；进样量：2～10μl；波长：284nm。

27、采用梯度洗脱：0min a:b为20:80；2min a:b为25:75；22min a:b为 48.4:51.6；22.01min a:b为20:80；27min a:b为20:80；27.01min结束，所述的梯度洗脱并不仅限于上述梯度洗脱比例。

28、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

29、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

30、本发明提供了一种强化生物基戊二胺合成的方法，通过添加无机盐，改变反应微环境，提高了赖氨酸脱羧酶的反应活性和稳定性，使得赖氨酸脱羧酶在偏碱性条件下保持了较高的催化活性，同时也提高了相应的热稳定性；同时这种强化生物基戊二胺的合成的方法，显著提高了利用赖氨酸脱羧酶高浓度合成生物基戊二胺的催化效率，具有极高的工业应用前景。