一种帕金森病认知障碍的判定标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及医学生物技术领域，特别涉及一种帕金森病认知障碍的判定标志物及其应用。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson’s disease，pd)，是一种临床常见的神经系统变性疾病。除了典型的静止性震颤、运动迟缓、肌强直等运动症状，诸多非运动症状，包括帕金森病认知障碍(parkinson’s disease with cognitive impairment，pd-ci)，同样会严重影响患者的生活质量，甚至超越运动症状成为晚期pd患者致残的主要因素(chaudhuri kr,et al；national institute for clinical excellence.non-motor symptoms of parkinson's disease:diagnosis and management.lancet neurol.2006；5(3):235-245.)。
3.依据疾病严重程度，pd-ci分为帕金森病轻度认知障碍(parkinson’s disease with mild cognitive impairment，pd-mci)及帕金森病痴呆(parkinson’s disease with dementia，pdd)。pd-mci是pd-ci的早期阶段，是pdd发生的独立危险因素(goldman jg,et al.defining optimal cutoff scores for cognitive impairment using movement disorder society task force criteria for mild cognitive impairment in parkinson's disease.mov disord.2013；28(14):1972-1979)。每年pd-mci患者进展为pdd的几率为6％-15％，5年内向pdd进展的转化率约39％(pedersen kf,et al.natural course of mild cognitive impairment in parkinson disease:a 5-year population-based study.neurology.2017；88(8):767-774)。pd-ci的发生发展严重影响患者的生活质量，早期诊治pd-mci对减缓或预防pdd具有重要意义。然而目前pd-mci的诊断标准主要基于临床神经心理学评估(litvan i,et al.diagnostic criteria for mild cognitive impairment in parkinson's disease:movement disorder society task force guidelines.mov disord.2012；27(3):349-356)，缺乏理想的生物学标志物。
4.越来越多的研究证实肠道菌群失调参与pd发生发展。既往研究发现pd患者肠道中的普雷沃氏菌属丰度减少和大肠杆菌属丰度增多与pd患者的姿势和步态障碍评分呈正相关(scheperjans f,et al.gut microbiota are related to parkinson's disease and clinical phenotype.mov disord.2015；30(3):350-8)。肠道菌群同样被发现与认知障碍存在一定关联(akbari e,et al.effect of probiotic supplementation on cognitive function and metabolic status in alzheimer's disease:arandomized,double-blind and controlled trial.front aging neurosci.2016；8:256；lee hj,etal.lactobacillus johnsonii cjlj103 attenuates scopolamine-induced memory impairment in mice by increasing bdnf expression and inhibiting nf-κb activation.j microbiol biotechnol.2018；28(9):1443-1446)。与其他生物标志物相比，非侵入性的肠道菌群标志物在临床更为可行。
5.肠道菌群代谢产物可能是肠道菌群在体内发生作用的重要环节，当代谢平衡出现
紊乱，可能出现神经递质失衡、能量代谢紊乱、线粒体功能异常等代谢通路障碍，引起中枢功能障碍。既往研究发现肠道菌群代谢物短链脂肪酸(short chain fatty acid，scfa)将促进神经炎症的发生，进一步使pd恶化(sampson tr,etal.gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of parkinson's disease.cell.2016dec 1；167(6):1469-1480.e12.)。这提示我们scfa与pd的发生发展具有一定关联。
6.pd-mci患者的特征性肠道菌群及血scfa浓度可能成为判定pd-ci的新的生物标记物，能够更简便地辨别pd-mci患者及认知功能的变化。


技术实现要素：

7.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种帕金森病认知障碍的判定标志物。
8.本发明的另一目的在于提供上述帕金森病认知障碍标志物的应用。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种帕金森病认知障碍的判定标志物，为标志物a和标志物b中的一种或两种；
10.标志物a为丁酸单胞菌属(butyricimonas sp.)、巴恩斯氏菌属(barnesiella sp.)、气味杆菌属(odoribacter sp.)及别样杆菌属(alistipes sp.)中的一种或两种以上细菌的相对丰度构成；
11.标志物b为外周血中异丁酸和/或异戊酸的浓度。
12.所述的相对丰度通过如下步骤得到：从检体中提取肠内细菌dna，经pcr扩增，得到的pcr产物通过高通量测序及物种聚类分析，统计得到物种丰度。
13.所述的检体包括肠液、粪便等消化道内容物，由于是非侵袭的方式，因而优选将粪便作为检体。
14.所述的判定标志物为标志物a时，所述的帕金森病认知障碍优选为帕金森病轻度认知障碍(pd-mci)。
15.所述的判定标志物为标志物a和标志物b时，不仅可以对pd-mci进行判断，还可以对认知功能变化进行判断。
16.所述的判定标志物在制备判定pd-mci的试剂盒中的应用。
17.一种判定pd-mci的试剂盒，包括pd-mci的判断标准。
18.所述的判定pd-mci的试剂盒，还包括肠内细菌dna提取试剂、用于扩增细菌16s rrna基因的v3-v4高变区序列的引物对和检测规程中的至少一种。
19.所述的pd-mci的判断标准如下：
20.在满足以下基准的1个以上时可以判定pd-mci可能性高，这些基准也可以组合使用：
21.(1)任意时刻的丁酸单胞菌属的相对丰度高于0.0076；
22.(2)任意时刻的巴恩斯氏菌属的相对丰度高于0.0106；
23.(3)任意时刻的气味杆菌属的相对丰度高于0.0041；
24.(4)任意时刻的别样杆菌属的相对丰度高于0.0297。
25.所述的用于扩增细菌16s rrna基因的v3-v4高变区序列的引物对优选如下：
26.引物357f：5'-actcctacggraggcagcag-3’；
27.引物806r：5'-ggactachvgggtwtctaat-3'。
28.所述的检测规程包括如下步骤：
29.(a)pcr扩增和高通量测序
30.(a)pcr扩增：将用于扩增细菌16s rrna基因的v3-v4高变区序列的引物对对细菌16s rrna基因的v3-v4高变区序列进行pcr扩增，对pcr扩增得到的pcr产物纯化，得到纯化的pcr产物；
31.(b)测序：将纯化的pcr产物进行荧光定量，利用桥式pcr、边合成边测序的方式完成测序；
32.(b)测序结果生物信息学分析
33.(a)生物信息学分析
34.1)物种聚类分析：运用软件usearch去除嵌合序列后得到用于分类的操作分类单元，采用mothur软件以置信水平0.8匹配otu代表序列与数据库；相似性等于或者大于97％的序列即为同一otu；
35.2)物种丰富度统计：基于分类学信息，于属水平进行菌群群落结构的统计分析；稀释性曲线评估样品的测序深度是否达标；当曲线趋向平坦时，说明测序深度合理，测序量足够。
36.步骤(a)(b)中所述的荧光定量的仪器优选为pcrftc-3000tm real-time pcr仪。
37.步骤(a)(b)中所述的测序的仪器优选为illumina miseq2
×
300碱基对平台。
38.所述的判定标志物在制备判定帕金森病认知障碍变化程度的试剂盒中的应用。
39.一种判定帕金森病认知障碍变化程度的试剂盒，包括变化程度的判断标准。
40.上述判定帕金森病认知障碍变化程度的试剂盒，还包括用于提取异丁酸和异戊酸的试剂、异丁酸标准品和异戊酸标准品中的至少一种。
41.所述的变化程度的判断标准如下：将不同时刻的患者血中的异丁酸和/或异戊酸的浓度进行比较，如果随着时间的推移，异丁酸和/或异戊酸的浓度升高，则认知程度降低；如果随着时间的推移，异丁酸和/或异戊酸的浓度降低，则认知程度得以改善。
42.一种综合分析帕金森病认知障碍的试剂盒，包括pd-mci的判断标准和变化程度的判断标准。
43.所述的pd-mci的判断标准如下：
44.在满足以下基准的1个以上时可以判定pd-mci可能性高，这些基准也可以组合使用：
45.(1)任意时刻的丁酸单胞菌属的相对丰度高于0.0076；
46.(2)任意时刻的巴恩斯氏菌属的相对丰度高于0.0106；
47.(3)任意时刻的气味杆菌属的相对丰度高于0.0041；
48.(4)任意时刻的别样杆菌属的相对丰度高于0.0297。
49.所述的变化程度的判断标准如下：将不同时刻的患者血中的异丁酸和/或异戊酸的浓度进行比较，如果随着时间的推移，异丁酸和/或异戊酸的浓度升高，则认知程度降低；如果随着时间的推移，异丁酸和/或异戊酸的浓度降低，则认知程度得以改善。
50.本发明提供的标志物和试剂盒可用于研究pd患者认知功能障碍发展的机理研究。
51.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
52.(1)本发明从宏基因组水平及代谢组水平研究pd-ci患者肠道菌群及代谢物的构成特点，有助于更加全面地理解pd-ci的病理机制。利用pd-mci患者、pd-nc患者及健康对照(health control，hc)的肠道菌群相对丰度，筛选出早期识别pd-mci患者的肠道微生物，之后以筛选出的肠道微生物作为检测指标综合判断，并通过血中脂肪酸浓度变化为指标评估可能的认知功能恶化，有助于早期干预以减缓或治疗pd-ci的发展。
53.(2)本发明发明人发现pd患者的粪便中的上述肠内细菌的相对丰度与pd-mci之间存在显著的相关性，且异丁酸及异戊酸浓度与整体认知水平具有相关性。具体而言，丁酸单胞菌属、巴恩斯氏菌属、气味杆菌属及别样杆菌属中的至少1种、优选2种以上的肠内细菌的相对丰度少时，可以判定pd-mci可能性提高；当异丁酸和/或异戊酸水平升高时，可以判定pd认知功能可能恶化。根据本发明，能够通过测定特定的肠内细菌的相对丰度来判定pd-mci，并通过血中脂肪酸浓度变化为指标评估可能的认知功能恶化。
具体实施方式
54.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
55.实施例1：初步探索pd-ci患者肠道菌群及代谢物特征
56.1、临床资料收集：筛选帕金森病轻度认知障碍(pd-mci)患者13例、帕金森病认知功能正常(pd-nc)患者14例及健康对照(hc)13例，收集受试者一般临床资料：对三组受试者的年龄、性别、身体体重指数(bmi)、教育年限、合并疾病、使用药物、饮食情况和wexner评分(便秘程度评分)进行统计，采用蒙特利尔认知评估量表(moca)和简易精神状态检查表(mmse)进行整体认知功能评估；并收集pd患者的病程、mds-updrsⅲ评分、hoehn-yahr分级、日常生活能力量表和39项帕金森病生活质量问卷，进行韦氏智力测验、韦氏记忆测验量表等认知域评估。
57.2、肠道菌群检测：
58.(1)粪便样本采集：采集新鲜的、中后段、内部的粪便，收集于含有保存液的专用的无菌微生物dna采集保存管中(上海微基生物有限公司提供)。样本采集量≥2g。粪便采集完成2小时内﹣80℃冰箱冻存。
59.(2)粪便样本dna提取：采用qiaamp dna stool mini kit试剂盒进行样本中微生物dna的提取。用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测提取细菌基因组dna的质量。
60.(3)pcr扩增和高通量测序(high-throughput sequencing，hts)
61.(a)pcr扩增：对细菌16s rrna基因的v3-v4高变区序列进行pcr扩增。用引物357f(5'-actcctacggraggcagcag-3’)和806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3')pcr扩增目的片段16s rdnav3-v4区。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测。
62.(b)测序：全部pcr产物使用axyprep dna凝胶回收试剂盒进行回收。ftc-3000tm real-time pcr仪进行荧光定量，illumina miseq2
×
300碱基对平台上利用桥式pcr、边合成边测序的方式完成测序。
63.(4)测序结果生物信息学分析
64.(a)生物信息学分析
65.1)物种聚类分析：运用软件usearch(v8.1.1756，http://drive5.com/uparse/)去
除嵌合序列后得到otu，采用mothur软件(1.33.3)以置信水平0.8匹配otu代表序列与数据库。相似性等于或者大于97％的序列即为同一otu。
66.2)物种丰富度统计：基于分类学信息，于属水平进行菌群群落结构的统计分析；稀释性曲线评估样品的测序深度是否达标；当曲线趋向平坦时，说明测序深度合理，测序量足够。
67.3、scfa检测：从血标本中提取，标准由sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)和sinopharm化学试剂有限公司(中国上海)提供，最低纯度为98％。采用单四极质谱仪(5975b-msd)和6890n gc(agilent technologies,santa clara,ca,usa)进行scfa测量。
68.4、统计解析：应用spss 20.0软件进行以下相关统计分析。服从正态分布、满足方差齐性的计量资料，使用t检验(两组间)或单因素方差分析(三组间)进行比较。不符合正态分布的计量资料，使用wilcox检验(两组间)或使用kruskal-wallis检验(三组间)进行比较，计量资料采用均数
±
标准差(x
±
s)表示。对计数资料使用率或构成比表示，组间比较使用
ⅹ2检验或者fisher确切概率法。运用glm识别三组间主要差异菌属。采用spearman相关分析计算患者认知水平与scfa浓度之间的相关性。
69.5、结果：
70.(1)患者信息
71.在表1中示出hc、pd-mci、pd-nc的临床资料信息。
72.表1三组间一般临床资料的比较
[0073][0074]
注：三组之间比较采用单因素方差分析，检验水准为0.0167。两组之间比较采用成组t检验，检验水准为0.05。率或构成比的比较采用x2检验或fisher确切概率法，检验水准
为0.05。括号里的数值是sd。
[0075]
(2)pd-mci与菌组成的相关
[0076]
排除各组间年龄、性别、便秘评分及教育程度等混杂因素影响后，对pd-mci与肠道菌群丰度的相关性进行调查。通过glm分析，发现巴恩斯氏菌属、丁酸单胞菌属、气味杆菌属及别样杆菌属为pd-mci组的主要差异菌群(表2)。且巴恩斯氏菌属、丁酸单胞菌属、气味杆菌属及别样杆菌属在pd-mci患者粪便样本中丰度较其余两组显著增高(p《0.05)。通过上述方法筛选出的肠道微生物相对丰度于表3示出。由此，认为选自丁酸单胞菌属、巴恩斯氏菌属、气味杆菌属及别样杆菌属中的一种以上的肠内细菌的相对丰度可以用作一种pd-mci的判定标志物。
[0077]
表2 glm分析得出三组间主要差异物种
[0078][0079]
表3主要差异菌属及相对丰度
[0080][0081]
(3)pd认知功能与scfa变化的相关
[0082]
采集患者外周血，外送检测公司进行检测，检测方法如下：从血中提取异丁酸及异戊酸，标准由sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)和sinopharm化学试剂有限公司(中国上海)提供，最低纯度为98％，采用气相-质谱方法(单四极质谱仪(5975b-msd)和6890n gc(agilent technologies,santa clara,ca,usa))对外周血中的细菌代谢产物scfas进行检测。
[0083]
对scfa浓度和mmse评分进行spearman相关分析。结果显示，异丁酸和异戊酸水平与mmse评分呈负相关(spearman相关系数分别为-0.37，-0.34)。提示异丁酸和/或异戊酸浓度的升高与认知水平的下降相关。由此，认为对患者的血中异丁酸和/或异戊酸浓度进行测定，当异丁酸和/或异戊酸水平较前升高时，可以判定pd认知功能可能恶化。
[0084]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。