与黑色素瘤相关的生物标志物及其在诊疗中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及与黑色素瘤相关的生物标志物及其在诊疗中的应用，更具体地，本发明涉及黑色素瘤相关的生物标志物包括mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a。


背景技术：

2.黑色素瘤(melanoma)是一种来源于表皮基底层黑色素细胞的高度恶性肿瘤，该肿瘤好发于皮肤或邻近皮肤的粘膜组织，黑色素瘤是最具侵袭性和致死性的皮肤癌，在过去的几十年里，黑色素瘤在全球的发病率和死亡率呈现急剧上升的趋势。然而，导致黑色素瘤患者死亡的主要原因是肿瘤易发生快速转移。黑色素瘤具有恶性程度高、进展迅速，转移早等特征，而且，近年来，免疫疗法和靶向治疗方法的飞速进展使得黑色素瘤的临床病史发生了革命性的变化，其治疗具有一定的效果，能够显著性地延长患者的生存期，但是这受限于临床的运用，并且对于已经出现了肿瘤转移的晚期黑色素瘤患者而言，目前仍然还没有令人满意的治疗方法。
3.目前，关于黑色素瘤的发病机制的研究还亟需进行进一步的深入探讨。越来越多的证据表明，黑色素瘤的病理形成涉及到多个基因、多个信号通路和基因调控的复杂变化。因此，鉴定黑色素瘤进展中的一些潜在的靶标分子，包括致癌基因和抑癌基因等，有望成为未来治疗黑色素瘤的新型靶点。微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类长度约为19
‑
24个核苷酸的内源性非编码rna分子，mirna可通过直接与其靶向调控基因的3
’‑
非翻译区的互补序列结合而在转录后水平上调节基因的表达，从而最终导致靶标基因降解或翻译抑制。研究表明，单个mirna可以调控超过100个基因的表达，同时，一个基因也可能被几个mirna进行靶向调控。
4.目前，已有大量的mirna已被注释，并预测大约有30％
‑
40％的人类基因受到mirna的调控。近年来，大量的研究显示，在多种实体癌症患者的肿瘤组织与其相对应的邻近肿瘤组织的正常组织之间存在mirna表达谱的失调，这可能是mirna的改变而诱发的表观遗传学改变、转录因子的活性改变或与mirna生物发生相关的酶改变而造成的结果。此外，已有证据表明，异常mirna的表达可通过下调肿瘤抑制基因或上调肿瘤促癌基因而促成许多癌症的发生、发展与进展。因此，mirna被认为是黑色素瘤发展过程中的关键调控因子。
5.鉴于此，本发明通过筛选与黑色素瘤相关的mirna，进而研究筛选得到的mirna作为黑色素瘤的生物标志物在诊断和治疗黑色素瘤中的应用，为黑色素瘤提供新的生物标志物，也为治疗黑色素瘤提供了新的途径。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供与黑色素瘤相关的生物标志物及其在诊疗中的应用，所述黑色素瘤相关的生物标志物包括mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a，本发明提供了mirna黑色素瘤诊断和治疗标志物组合、芯片、试剂盒，能够简单有效且无创地对
黑色素瘤进行诊断，此外，所述mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a三者联合对黑色素瘤的治疗具有协同增效的作用。
7.本发明公开的生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的序列均可在mirbase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中进行查询，其中，mir
‑
155的序列如seq id no:16所示，mir
‑
27b
‑
5p的序列如seq id no:17所示，mir
‑
450a的序列如seq id no:18所示；
8.mir
‑
155的序列：
9.cuguuaaugcuaaucgugauagggguuuuugccuccaacugacuccuacauauuagcauuaacag(seq id no:16)
10.mir
‑
27b
‑
5p的序列：
11.agagcuuagcugauuggugaac(seq id no:17)
12.mir
‑
450a的序列：
13.aaacgauacuaaacuguuuuugcgauguguuccuaauaugcacuauaaauauauugggaacauuuugcauguauaguuuuguaucaauaua(seq id no:18)
14.进一步，本发明中所述的mir
‑
155、mir
‑
450a包括mir
‑
155、mir
‑
450a初始mirna、mir
‑
155、mir
‑
450a前体mirna、成熟mir
‑
155、mir
‑
450a，所述mir
‑
155、mir
‑
450a初始mirna在人细胞内被剪切并表达为成熟mir
‑
155、mir
‑
450a，所述mir
‑
155、mir
‑
450a前体mirna在人细胞内被剪切并表达为成熟mir
‑
155、mir
‑
450a。作为进一步的优选，所述mir
‑
155、mir
‑
450a还包括：对mir
‑
155、mir
‑
450a进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列。
15.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
16.本发明提供了检测生物标志物表达水平的试剂在制备诊断黑色素瘤产品中的应用。
17.进一步，所述生物标志物为mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a。
18.进一步，所述试剂选自：
19.特异性识别所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的寡核苷酸探针；或
20.特异性扩增所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的引物。
21.进一步，特异性扩增所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的引物的序列分别如seq id no:8
‑
seq id no:9、seq id no:10
‑
seq id no:11、seq id no:12
‑
seq id no:13所示。
22.进一步，所述产品包括：通过实时定量pcr、rt
‑
pcr、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a表达水平的试剂。
23.进一步，所述实时定量pcr是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个pcr进程，并对起始模板进行定量分析的方法。实时定量pcr可分别为sybr green荧光染料法和taqman探针法，其中，在taqman探针法的定量pcr反应体系中，包括一对pcr引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团(reporter，r)，如fam、vic等，3’端标记有荧光淬灭基团(quencher，q)，如tamra等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着pcr反应的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3
’→5’
外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭基团，能量不能被吸收，就产生荧光信号。因此每经过一个循环，荧光信号就和目的片段一样有一个同步指数
增长过程。
24.进一步，所述rt
‑
pcr是指先将成熟的mirna转化成cdna序列，然后利用qpcr进行扩增。这种技术可以在标准的设备上自动化开展，因此如今已被广泛使用。rt
‑
pcr方法的灵敏度、特异性和重复性都较好。此外，所述的rt
‑
pcr不仅包括传统的实时定量rt
‑
pcr，还包括stem
‑
loop实时定量rt pcr技术，stem loop实时定量rt pcr是一项高特异度、敏感度的检测mirna表达的实验技术，包括设计具有茎环(stem loop)结构的反转录引物和用mirna荧光标记的特异分子探针进行实时pcr两个关键步骤。该技术具有以下优点：高度特异性，对序列高度同源的mirna也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度；样品消耗少，仅需1
‑
10ng的总rna；适用范围广，总rna、细胞裂解物以及纯化的rna都可用于mirna的定量检测。
25.进一步，所述原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测mirna表达，可更直观的展示出mirna的时空表达模式。它不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的mirna表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中mirna的表达水平。它是分析mirna表达组织和时序特异性的有力工具。
26.本发明提供了一种诊断黑色素瘤的产品。
27.进一步，所述产品包含检测所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a表达水平的试剂。
28.进一步，所述产品包括芯片、试剂盒；
29.优选地，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的特异性识别所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的寡核苷酸探针；
30.优选地，所述试剂盒包括特异性结合所述生物标志物mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的引物、探针或芯片。
31.进一步，所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品、poly
‑
a加尾酶、逆转录酶、dntps、逆转录缓冲液、无rna酶水、qpcr缓冲液、氯化镁、dna聚合酶、sybrgreen荧光染料中的至少一种。
32.进一步，所述poly
‑
a加尾法是对mirna进行反转录，故反转录引物和ppcr的反向引物均为通用引物，仅通过qpcr的正向引物识别3种mirna标志物及内参u6即可。
33.本发明提供了生物标志物在制备治疗黑色素瘤的药物组合物中的应用。
34.进一步，所述生物标志物为mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a。
35.进一步，所述药物组合物包括降低mir
‑
155表达水平的抑制剂、升高mir
‑
27b
‑
5p表达水平的促进剂、降低mir
‑
450a表达水平的抑制剂；
36.优选地，所述降低mir
‑
155表达水平的抑制剂的序列如seq id no:1所示；
37.优选地，所述升高mir
‑
27b
‑
5p表达水平的促进剂的序列如seq id no:2
‑
seq id no:3所示；
38.优选地，所述降低mir
‑
450a表达水平的抑制剂的序列如seq id no:4所示。
39.进一步，本发明所述的药物组合物还包括药物学上可接受的载体，通过常规制药工艺将有效成分
‑
抑制或促进所述生物标志物表达的物质与药物学上可接受的载体制备成本发明所述的药物组合物。
40.本发明提供了一种筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物的方法。
41.进一步，所述方法包括如下步骤：
42.(1)将待测物质与含有或表达mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的体系接触；
43.(2)检测所述体系中mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的表达水平；
44.(3)选择可同时降低mir
‑
155和mir
‑
450a的表达水平、升高mir
‑
27b
‑
5p的表达水平的物质为预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物。
45.进一步，所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
46.本发明提供了生物标志物在筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物中的应用。
47.进一步，所述生物标志物为mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a。
48.除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。
49.本文中使用的术语“治疗”，通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使病症发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
50.本文中使用的术语“生物标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者其他方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。其和“标志物”、“mirna标志物”或“分子标志物”可通用，在本发明的具体实施例中，所述生物标志物为mirna标志物，更具体地，所述mirna标志物包括mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a。
51.本文中使用的术语“差异表达”，是指与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定样品中生物标志物的表达水平或表达量，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的表达水平之间存在差异，在本发明的具体实施例中，所述生物标志物为mirna标志物，更具体地，所述mirna标志物包括mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a。
52.本文中使用的术语“上调”，是指生物标志物相对于对照而言，其表达水平或表达量显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。
53.本文中使用的术语“下调”，是指生物标志物相对于对照而言，其表达水平或表达量显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少。
54.本文中使用的术语“抑制剂”或“降低生物标志物表达水平的抑制剂”，是指mirna inhibitor，mirna inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶mirna的抑制剂，特异地靶向和敲除单个的mirna分子，可以削弱内源mirna的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性(loss
‑
of
‑
function)研究，可以用来筛选mirna靶位点，筛选调控某一基因表达的mirna，筛选影响细胞发育过程的mirna。mirna inhibitor是化学修饰的rna单链，能够与成熟mirna序列竞争性结合，其易于获得，操作简便，实验周期短，可以很好地应用于mirna功能分析研究，如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、细胞迁移、干细胞生长等方面功能
expression omnibus)，从geo数据库中下载黑色素瘤数据集gse35579和gse20994，所述数据集中包括基因表达数据和完整的临床注释，其中，下载的数据集gse35579作为验证集，样本量为case：control＝41：11，下载的数据集gse20994作为训练集，样本量为case：control＝35：22。
66.2、数据预处理
67.对上述从geo数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理，对标准化后的基因表达矩阵通过注释文件(platform文件)进行注释，多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量。
68.3、差异表达分析
69.采用r语言软件中的“limma”包对上述数据集gse35579和gse20994中的数据进行差异表达分析，差异表达基因的筛选标准为：adj.p value<0.05，|log2fc|>0.5。
70.4、实验结果
71.结果见表1和图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f，经筛选得到的差异表达mirna mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a在训练集和验证集中呈显著性的差异表达，其中，mir
‑
155在黑色素瘤中的表达显著上调，mir
‑
27b
‑
5p在黑色素瘤中的表达显著下调，mir
‑
450a在黑色素瘤中的表达显著上调。
72.表1mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a在训练集和验证集中差异表达的结果
[0073][0074]
实施例2诊断效能验证
[0075]
1、实验方法
[0076]
对实施例1中筛选得到的差异表达mirna mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a，采用r包“proc”(版本1.15.0)绘制受试者工作特征曲线(roc曲线)，分析其敏感性、特异性、auc值，以判断所述mirna单独和联合时在训练集和验证集中的诊断效能；
[0077]
在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时，直接使用所述mirna的表达量进行分析，选择youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，auc在0.5<auc<0.8的基因被用于联合分析；
[0078]
在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时，对各mirna的表达水平进行logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率
划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。
[0079]
2、实验结果
[0080]
结果见表2和图2a、图2b、图2c、图2d、图2e、图2f、图3a、图3b，结果显示mirna组合mir
‑
155+mir
‑
27b
‑
5p+mir
‑
450a联合对黑色素瘤的诊断效果显著优于单个mirna的诊断效果，在训练集和验证集中的auc值分别为0.871和0.962，表明了上述mirna组合mir
‑
155+mir
‑
27b
‑
5p+mir
‑
450a联合具有较好的诊断效能，能够应用于黑色素瘤的诊断中。
[0081]
表2mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a、mir
‑
155+mir
‑
27b
‑
5p+mir
‑
450a联合在训练集和验证集中的诊断效能结果
[0082][0083]
实施例3mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的表达与黑色素瘤细胞的凋亡的关系研究
[0084]
1、实验材料
[0085]
实验中涉及到的主要实验器材和实验试剂及耗材见表3和表4。
[0086]
表3实验中涉及的主要器材
[0087]
名称厂家型号微量移液器eppendorf248692z超净工作台zj苏州净化16052007co2恒温培养箱yiliangycp系列倒置显微镜canon126281低速离心机eppendorf47103
[0088]
表4实验中涉及的主要试剂
[0089]
名称厂家货号lipofectamine 2000invitrogen#11668
‑
019dmemgibcoc11995500bt
细胞培养皿、细胞培养瓶corning 其它化学试剂国产分析纯 fbsgibco10270p/s solutionsclencellno.0503
[0090]
2、细胞来源
[0091]
黑色素瘤细胞a375购自于中国科学院上海细胞生物研究所，引进后在本实验室长期培养。a375培养基为以dmem+10％fbs+1％p/s solution，37℃、5％co2、95％空气、饱和湿度的条件下进行培养。
[0092]
3、细胞培养
[0093]
(1)a375黑色素瘤细胞复苏
[0094]
细胞复苏法使用的是水浴锅内快速融化的方法。实验之前进行防护，穿戴好手套及防护面具，从液氮中取出一支a375黑色素瘤细胞冻存管，注意观察标签名称、冻存日期等信息，确定是需要的细胞，然后快速放入已经备好的37℃的水浴锅中，整个过程一定要快速，最好在1min时间内把冻存液完全融化，此时注意无菌操作防止感染，特别注意瓶盖处防护，完成融化后使用吸管把冻存的细胞转移到离心管中，加入pbs缓冲溶液均匀吹打，保证完全融入pbs缓冲溶液中，然后把离心管放入离心机中，调整转速1000rpm/min，时间维持5min左右，取出上清，保留离心管底层的物质，加入适量dmem完全培养基重新悬浮，按照1:2种植于t25培养瓶中，每个培养瓶中加入dmemf完全培养基5ml，于镜下可见悬浮的圆形的细胞，代表已经把细胞转移成功，然后放入含有5％co2、37℃恒温的细胞孵育箱中进行培养；
[0095]
(2)a375黑色素瘤细胞换液
[0096]
a375黑色素瘤细胞开始贴壁的时间一般是大约4
‑
6h左右，一般一天的时间就可以完全贴壁，贴壁后的细胞呈多边形，可以根据观察培养液的颜色及镜下观察情况进行换液，注意dmem完全培养基要在37℃恒温水浴锅中提前预热，可以用巴氏管吸取上面的陈旧培养液，尽可能不要接触培养皿的下部，防止底层细胞造成划痕，细胞生长不均匀。然后沿着侧壁慢慢加入37℃水浴预热的pbs缓冲溶液进行清洗，去除一些坏死的细胞，可以用37℃水浴预热的pbs冲洗三次，最后在培养皿中加入37℃水浴预热的5ml dmem完全培养基，放入5％co2、37℃恒温孵育箱培养。整个过程注意无菌操作，巴氏管接触外界后要及时丢弃，过程干净利索，不宜过长时间；
[0097]
(3)a375黑色素瘤细胞传代
[0098]
约2
‑
3天，a375黑色素瘤细胞就可以达到80％
‑
100％的细胞融合，此时进行细胞传代。实验之前要进行个人防护，在提前消毒30min的超净工作台中，使用巴氏管，吸弃陈旧的培养液，使用37℃水浴预热的pbs冲洗三次，加入1ml浓度为0.25％胰蛋白酶，放入37℃恒温孵育箱中，计时1min左右，为明确细胞是否完全被消化，可以在倒置显微镜下观察，如果见圆形的细胞大部分悬浮，就可停止胰蛋白酶消化，加入1
‑
2ml的37℃水浴预热的5
‑
10ml dmem/f
‑
12完全培养基，同时及时吹打细胞，使细胞完全悬浮溶液中，然后转移到离心管中，配平离心机，调整转速1000rpm/min，离心时间5min左右，按照1:3
‑
1:5的比例进行传代，培养皿放入5
‑
10ml dmem/f
‑
12完全培养基，放入37℃、5％co2的细胞恒温孵育箱中进行培养。
[0099]
4、细胞转染
[0100]
(1)取处于对数生长期的a375细胞，生长状态良好的细胞，用培养基将细胞密度调
整到1
×
105/ml，接入6孔板，每孔2ml细胞悬液，每组各两孔，37℃培养过夜；
[0101]
(2)转染前2小时，换成无血清培养基；
[0102]
(3)转染步骤，对于每个转染样品，均按如下所述的方法进行准备：
[0103]
1)转染前一天将细胞计数，取1ml加入6孔板中，使得孔板的细胞密度不低于2
×
105个；
[0104]
2)对于每孔细胞，用250μl的无血清培养基稀释10μl的100nm的inhibitor或mimics，室温孵育5min；
[0105]
3)对于每孔细胞，用250μl的无血清培养基稀释5μl lipo2000，室温孵育5min；
[0106]
4)将步骤2)和步骤3)中的液体混合，室温孵育20min；
[0107]
5)将预先分好的贴壁细胞换成无血清培养基，加入上述复合物，在37℃，5％co2中培养6小时，再换成加血清的生长培养基，继续在37℃，5％co2中培养48小时。收集细胞样本，pbs洗两次，弃去液体，进行后续rna的提取；
[0108]
将实验设置为3个组：空白对照组(a375黑色素瘤细胞)、阴性对照组(inhibitor
‑
nc或mimics
‑
nc组)和实验组(inhibitor或mimics组)。
[0109]
其中，针对mir
‑
155的inhibitor的序列信息如下：
[0110]5’‑
aaccccuaucacgauuagcauuaa
‑3’
(seq id no:1)
[0111]
针对mir
‑
27b
‑
5p的mimics的序列信息如下：
[0112]
正义链为5
’‑
agagcuuagcugauuggugaac
‑3’
(seq id no:2)
[0113]
反义链为5
’‑
guucaccaaucagcuaagcucu
‑3’
(seq id no:3)
[0114]
针对mir
‑
450a的inhibitor的序列信息如下：
[0115]5’‑
auauuaggaacacaucgcaaaa
‑3’
(seq id no:4)
[0116]
inhibitor
‑
nc的序列信息如下：
[0117]5’‑
caguacuuuuguguaguacaaa
‑3’
(seq id no:5)
[0118]
mimics
‑
nc的序列信息如下：
[0119]
正义链为5
’‑
uuuguacuacacaaaaguacug
‑3’
(seq id no:6)
[0120]
反义链为5
’‑
caguacuuuuguguaguacaaa
‑3’
(seq id no:7)
[0121]
5、qpcr检测细胞中mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a的表达水平
[0122]
(1)样本总rna的提取(trizol法)
[0123]
1)取适量待测样本加入液氮后研磨粉碎；
[0124]
2)用1ml trizol将研磨样本转移到1.5ml ep管中；
[0125]
3)向1.5ml ep管中加入500μl酚氯，仿振荡混匀后，静止5分钟；
[0126]
4)4℃12000rpm离心10分钟，小心吸取上清于一新的1.5ml ep管中；
[0127]
5)向分离出的上清中加入700μl异丙醇，充分混匀；
[0128]
6)4℃12000rpm离心10分钟，小心弃上清；
[0129]
7)用75％乙醇洗涤沉淀一次，室温晾干；
[0130]
8)50μl depc水溶解rna沉淀；
[0131]
9)琼脂糖凝胶电泳检测。
[0132]
(2)总rna质量检测
[0133]
1)使用核酸浓度测定仪测定rna浓度和纯度，测量前先用溶解rna用的depc水调
零，操作方法如下：抬起样品臂，把样品加到检测基座上；放下样本臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。在上下两个光纤之间会自动拉出一个样品柱，然后进行检测；当检测完成后，抬起样品臂，并用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦拭干净；
[0134]
2)浓度测定：260nm处读值为1表示40ng rna/μl。样品rna浓度计算公式为：a260 x 40ng/μl；
[0135]
3)纯度检测：rna溶液的a260/a280的比值是一种rna纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。
[0136]
(3)逆转录合成cdna
[0137]
逆转录使用invitrogen的逆转录试剂盒superscript iii；
[0138]
反应体系1的建立见表5，混匀，离心，65℃，5分钟，结束后置于冰上；
[0139]
表5反应体系1的组成
[0140]
反应体系1组成各组分含量rna200ng(10μl)oligo
‑
dt1μl
[0141]
反应体系2的建立见表6；
[0142]
表6反应体系2的组成
[0143]
反应体系2组成各组分含量反应体系112μldntp(10μm)1μl0.1m dtt2μl5x buffer4μlrt酶1μl
[0144]
混匀，离心，置于42℃，水浴60分钟；取出后置于85℃，反应10分钟，灭活逆转录酶，反应结束后将产物置于
‑
20℃待用。
[0145]
(4)实时荧光定量检测
[0146]
首先设计qpcr的扩增引物，具体引物序列如下：
[0147]
mir
‑
155：
[0148]
正向引物为5
’‑
ttaatgctaatcgtgatagg
‑3’
(seq id no:8)；
[0149]
反向引物为5
’‑
ctcaactggtgtcgtg
‑3’
(seq id no:9)；
[0150]
mir
‑
27b
‑
5p：
[0151]
正向引物为5
’‑
agagcttagctgattggtg
‑3’
(seq id no:10)；
[0152]
反向引物为5
’‑
ctcaactggtgtcgtg
‑3’
(seq id no:11)；
[0153]
mir
‑
450a：
[0154]
正向引物为5
’‑
ttttgcgatgtgttcctaat
‑3’
(seq id no:12)；
[0155]
反向引物为5
’‑
ctcaactggtgtcgtg
‑3’
(seq id no:13)；
[0156]
u6内参引物：
[0157]
正向引物为5
’‑
gcttcggcagcacatatactaaaat
‑3’
(seq id no:14)；
[0158]
反向引物为5
’‑
cgcttcacgaatttgcgtgtcat
‑3’
(seq id no:15)；
[0159]
real time pcr反应体系建立见表7；
[0160]
表7 real time pcr反应体系
[0161]
反应体系组成各组分含量cdna2μlpcr mix10μlprimer f1μlprimer r1μlddh2o6μl
[0162]
体系混匀后，瞬离，置于荧光定量pcr仪上，按照表8所述的条件反应；
[0163]
表8 realtime pcr反应条件
[0164][0165]
对各组样本的相对定量结果进行分析，其中，mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a相对表达量的计算公式如下：
[0166][0167]
δct
q
＝待测组目的基因平均ct值
‑
待测组内参基因平均ct值
[0168]
δct
cb
＝对照组目的基因平均ct值
‑
对照组内参基因平均ct值
[0169]
6、细胞凋亡实验
[0170]
本实施例中采用流式细胞术检测mir
‑
155、mir
‑
27b
‑
5p、mir
‑
450a、mir
‑
155+mir
‑
27b
‑
5p+mir
‑
450a的表达对a375黑色素瘤细胞凋亡的影响，首先收集未经转染、转染mir
‑
155inhibitor、转染mir
‑
27b
‑
5p mimics、转染mir
‑
450a inhibitor、同时转染mir
‑
155inhibitor和mir
‑
27b
‑
5p mimics和mir
‑
450a inhibitor的a375黑色素瘤细胞，对细胞进行洗涤后用乙醇进行固定，并进行细胞的重悬和细胞过滤，并采用pi染液进行染色，之后采用流式细胞仪进行检测；
[0171]
其中，在细胞凋亡检测中，流式细胞术检测结果图中的不同象限代表不同的意义，q1
‑
1(annexinv
‑
fitc)
‑
/pi+代表坏死细胞，q1
‑
2(annexinv+fitc)+/pi+代表中晚期凋亡的细胞，q1
‑
4(annexinv
‑
fitc)+/pi
‑
代表早期凋亡的细胞，q1
‑
3(annexinv
‑
fitc)
‑
/pi
‑
代表正常的活细胞，各象限的百分数分别代表对应细胞所占的比例，细胞总凋亡率＝中晚期凋亡率+早期凋亡率。
[0172]
7、实验结果
[0173]
转染的结果显示，以空白对照组mir
‑
155的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组mir
‑
155的表达量(相对表达量为1)与转染inhibitor
‑
nc的阴性对照组(nc组)mir
‑
155的表达量，转染mir
‑
155inhibitor的实验组的mir
‑
155的表达量显著下调，且差异具有统计学意义(p＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异(见图4a)；
[0174]
转染的结果显示，以空白对照组mir
‑
27b
‑
5p的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组mir
‑
27b
‑
5p的表达量(相对表达量为1)与转染mimics
‑
nc的阴性对照组(nc组)mir
‑
27b
‑
5p的表达量，转染mir
‑
27b
‑
5p mimics的实验组的mir
‑
27b
‑
5p的表达量显著上调，且差异具有统计学意义(p＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异(见图4b)；
[0175]
转染的结果显示，以空白对照组mir
‑
450a的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组mir
‑
450a的表达量(相对表达量为1)与转染inhibitor
‑
nc的阴性对照组(nc组)mir
‑
450a的表达量，转染mir
‑
450a inhibitor的实验组的mir
‑
450a的表达量显著下调，且差异具有统计学意义(p＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异(见图4c)；
[0176]
细胞凋亡实验的结果显示，转染mir
‑
155inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率(10.16％)显著高于空白对照组(3.00％)和阴性对照组(3.17％)(见表9和图5a、图5b、图5c)，表明mir
‑
155能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，抑制mir
‑
155的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡；
[0177]
细胞凋亡实验的结果显示，转染mir
‑
27b
‑
5p mimics的实验组的细胞的总凋亡率(10.01％)显著高于空白对照组(3.00％)和阴性对照组(3.17％)(见表9和图5a、图5b、图5d)，表明mir
‑
27b
‑
5p能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，升高mir
‑
27b
‑
5p的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡；
[0178]
细胞凋亡实验的结果显示，转染mir
‑
450a inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率(10.26％)显著高于空白对照组(3.00％)和阴性对照组(3.17％)(见表9和图5a、图5b、图5e)，表明mir
‑
450a能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，抑制mir
‑
450a的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡；
[0179]
细胞凋亡实验的结果显示，共同转染mir
‑
155inhibitor和mir
‑
27b
‑
5p mimics和mir
‑
450a inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率(45.39％)显著高于单独转染mir
‑
155inhibitor的实验组(10.16％)和单独转染mir
‑
27b
‑
5p mimics的实验组(10.01％)和单独转染mir
‑
450a inhibitor的实验组(10.26％)(见表9和图5c、图5d、图5e、图5f)；
[0180]
此外，对各组的细胞抑制率进行计算，计算得到的结果见表10，利用金氏公式表达式q＝e
a+b+c
/(e
a
+e
b
+e
c
‑
e
a
×
e
b
×
e
c
)判断三者联合使用后的效果是否具有协同的效果，其中，e
a+b+c
为mir
‑
155inhibitor+mir
‑
27b
‑
5p mimics+mir
‑
450a inhibitor对黑色素瘤细胞的抑制率，e
a
为mir
‑
155inhibitor对黑色素瘤细胞的抑制率，e
b
为mir
‑
27b
‑
5p mimics对黑色素瘤细胞的抑制率，e
c
为mir
‑
450a inhibitor对黑色素瘤细胞的抑制率；若q＝0.85
‑
1.15之间为单纯叠加，1.15＜q＜20为协同，q＞20为显著协同，q＜0.85为拮抗，即q＞1.15时即可判定mir
‑
155inhibitor、mir
‑
27b
‑
5p mimics、mir
‑
450a inhibitor三者对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果，而非单纯叠加；
[0181]
根据表10计算得到的细胞抑制率的结果，利用金氏公式计算增效q值，评价mir
‑
155inhibitor、mir
‑
27b
‑
5p mimics、mir
‑
450a inhibitor三者联合的效应是否为协同效应，代入计算得到的细胞抑制率的结果可知，q＝e
a+b+c
/(e
a
+e
b
+e
c
‑
e
a
×
e
b
×
e
c
)＝0.4239/(0.0716+0.0701+0.0726
‑
0.0716
×
0.0701
×
0.0726)＝1.982，即q＝1.982，q＞1.15，表明了mir
‑
155inhibitor、mir
‑
27b
‑
5p mimics、mir
‑
450a inhi bitor三者联合对黑色素瘤细
胞的凋亡促进作用为协同效果，进一步证明了mir
‑
155inhibitor、mir
‑
27b
‑
5p mimics、mir
‑
450a inhibitor三者联合为协同治疗，而非单纯的叠加效果。
[0182]
表9细胞凋亡实验的结果统计
[0183][0184]
表10各组的细胞抑制率的计算结果
[0185][0186]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。