富硒富锌蝉花的栽培方法及其应用

本发明涉及虫草栽培技术，具体地说，涉及一种富硒富锌蝉花的栽培方法及其应用。

背景技术：

1、蝉花(isaria cicadae)，属于子囊菌门、虫草科、棒束孢属，是一种药食两用的虫生真菌。蝉花提取物中含有丰富的生物活性成分，蝉花多糖具有较好的抗氧化、抗肿瘤、降血脂作用；虫草酸具有降血压降血脂、代替糖类物质作为甜味剂的作用；虫草素具有一定的抗癌作用等。同时，蝉花具有冬虫夏草相似的活性成分，因栽培周期短，生物量多，成为冬虫夏草优选的替代品。野生蝉花由于自然条件的限制和人为因素的过度采挖，产量不能达到市场需求，且各品种之间的质量存在差异，因此可进行人工栽培，并通过调整培养基条件以获得高含量目标产品。

2、硒、锌是人体的必需微量元素，人体主要通过食物摄取的方式补充，以维持机体健康。人体缺硒会导致克山病、大骨节病等地方性病害，同时引起心血管疾病、癌症等疾病的高发，适量的硒摄入对健康有益，但摄入硒含量过高时也存在健康风险。在自然环境中，硒主要以硒酸盐、亚硒酸盐等无机硒和硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸、硒蛋白等有机硒，有机硒较无机硒具有更高的生物活性和安全性，且更易被动物消化吸收。中国营养学会确定人体硒摄入量适宜范围为60-400μg/d。锌也是人体必需的微量元素，锌能促进人体的正常发育，促进食欲，提高机体免疫能力，增强对疾病的抵抗力等，锌摄入缺乏会导致侏儒症和智力发育不良。中国营养学会推荐成年男性的锌摄入量为12.5mg/d，成年女性的锌摄入量为7.5mg/d，孕妇推荐锌摄入量为9.5mg/d。食用菌可以通过富硒、富锌栽培，提高子实体中的硒、锌含量，具有重要的生物学意义，但未见使用蝉花同时富硒和锌，而且同时提高虫草酸、腺苷等活性物质含量的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种富硒富锌蝉花的栽培方法及其应用。

2、本发明的另一目的是提供一株对硒具有较高耐受和有机硒转化能力的蝉花。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株对硒具有较高耐受能力的蝉花，即蝉棒束孢(isaria cicadae)m8，从浙江天目山的野生蝉花分离获得，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.21453，保藏日期2021年1月22日。蝉棒束孢m8的微生物学特征如下：菌落为圆形，表面蓬松，菌丝初期为白色，与培养基紧密贴合，后期淡黄色，产生大量分生孢子，转为灰色(图1)。分生孢子梗分支较浓密，产孢细胞基部椭圆形或球形膨大，单个分生孢子壁光滑、透明，长椭圆形或腰部微收缩呈略弯曲，大小为(5-14)μm×(1.4-2.9)μm，孢子多聚集呈现长链状(图2)，经查证，以上特征与《中国真菌志》中的蝉花(isaria cicadae)特征一致。

4、分子生物学鉴定结果如下：采用ctab法提取m8菌株的基因组dna，以its1f(5'-cttggtcatttagaggaagtaa-3')和its2r(5'-gctgcgttcttcatcgatgc-3')为引物，pcr扩增获得m8菌株的its的dna片段，pcr产物经纯化后测序获得its序列如seq id no:1所示，在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线数据库blast序列比对分析，结果显示m8菌株的its序列与蝉花isaria cicadae菌株的its序列有100％的相似度，结合形态学特征将m8菌株鉴定为蝉花isaria cicadae。

5、第二方面，本发明提供含有所述蝉棒束孢m8的菌剂或组合物。

6、第三方面，本发明提供所述蝉棒束孢m8在制备富硒和/或富锌蝉花中的应用。

7、第四方面，本发明提供一种富硒富锌蝉花的栽培方法，包括以下步骤：

8、a、菌种活化；

9、b、种子液的制备；

10、c、富硒富锌蝉花的栽培。

11、步骤c使用小麦培养基进行蝉花的栽培，且小麦培养基中添加有无机硒盐和/或纳米硒以及无机锌盐和/或有机锌盐。

12、所述小麦培养基的制作方法包括：将小麦与营养液按1:1～1.5(g/ml)的比例混合，于105-121℃高压灭菌20-30min。

13、所述营养液的配制如下：将糖20g、kh2po4 2g和mgso4·7h2o 1g混合，加水定容至1000ml。所述糖可选自葡萄糖、蔗糖或麦芽糖等中的至少一种。

14、所述无机硒盐包括硒酸盐(如硒酸钠)和/或亚硒酸盐(如亚硒酸钠)；所述纳米硒包括生物合成的纳米硒(参见cn201510047365.4、cn201610566900.1、cn201610952997.x、cn201610946230.6或cn201610946282.3)和/或化学合成的纳米硒(参见zl201410520106.4)；所述无机锌盐如硫酸锌等；所述有机锌盐如乙二胺四乙酸二钠锌等。

15、进一步地，小麦培养基中硒酸盐的浓度为0.5-100mg/kg，优选40mg/kg。

16、进一步地，小麦培养基中亚硒酸盐的浓度为0.5-100mg/kg，优选40mg/kg。

17、进一步地，小麦培养基中硫酸锌的浓度为60-120mg/kg，优选100mg/kg。

18、进一步地，小麦培养基中乙二胺四乙酸二钠锌的浓度为60-120mg/kg，优选100mg/kg。

19、前述的方法，步骤a包括：将蝉花接种至改良pda培养基，在20-25℃恒温培养箱中培养18-25天，至大量产孢。

20、所述改良pda培养基的配制如下：将马铃薯(土豆)200g、葡萄糖(或蔗糖或麦芽糖)20g、琼脂17g、蛋白胨3g、kh2po4 2g、mgso4·7h2o 1g和vb 30mg混合，加水定容至1000ml，于105-121℃高压灭菌20-30min。

21、前述的方法，取直径约5-9mm的活化蝉花菌饼接种至盛有200ml改良pd培养基的500ml培养瓶(锥形瓶)中进行摇培，摇培条件为：21℃，转速180r/min，摇培3天，得到种子液。

22、所述改良pd培养基的配制如下：将马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、kh2po4 2g、mgso4·7h2o 1g和vb 30mg混合，加水定容至1000ml，于105-121℃高压灭菌20-30min。

23、前述的方法，将液体种子液稀释3-7倍，向盛有小麦培养基的栽培瓶中加入稀释菌液5ml，每个栽培瓶中盛有20-30g小麦培养基；接完菌的栽培瓶转移至21℃恒温栽培室，相对湿度80％，避光培养4天后，进行12小时白光、12小时红光交替的光照培养35天，至子实体成熟，顶部产孢即可采收。采收的蝉花子实体在50℃的烘箱中烘干称重，磨碎待用。

24、所述白光的强度可以是200-400lx，所述红光的波长可以是620-760nm

25、优选地，所述蝉花为蝉棒束孢m8。

26、第五方面，本发明提供按照所述方法获得的富硒富锌蝉花的以下任一应用：

27、1)用于保健品领域；

28、2)用于食品领域；

29、3)用于饲料领域；

30、4)用于制备药物或组合物。

31、利用本方法栽培得到的蝉花子实体同时富集硒、锌两种元素，并保持了原有的活性物质，从而获得优质的富硒富锌蝉花子实体。特别是栽培培养基中添加了亚硒酸钠和硫酸锌，以及添加了亚硒酸钠和乙二胺四乙酸二钠锌，对应的蝉花子实体硒含量最高，锌含量较高，生物量较高，腺苷含量最高，虫草酸含量最高，提升了蝉花的营养和药用价值。