一种降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法与流程

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种动物细胞培养方法，特别涉及一种降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法及其用途。

背景技术：

1、随着现代医疗行业的高速发展，塑料制品的生产工艺的逐步完善，越来越多的公司开始生产一次性塑料培养产品，以前玻璃培养产品只有少量的规格可选，使用前繁琐的处理过程已经不能满足科研、生产等的实验要求，而一次性塑料培养产品的规格多样化、操作方便、成本低、容易处理等优点已给越来越多的人所接受。

2、一次性耗材由于生产成本低、使用方便、污染风险较低，在新工艺开发和中试规模生产中有广泛的应用。但是由于国内外不同公司一次性耗材材质差异，不同公司在不同时期的不同需求需要变更耗材，其溶出析出存在较大差异，对细胞培养工艺稳定性有较大的挑战。双(2,4-二叔丁基苯基)磷酸盐(bdtbpp)是一次性反应袋中抗氧化稳定剂三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸(tbpp)的降解剂，是第一种被鉴定为来自一次性生物反应袋subs的可浸出化合物，即使浓度低于百万分之几的水平，对哺乳动物细胞仍有剧毒。对于某些cho细胞系，当浸出的bdtbpp的浓度大于0.1mg/l时，就能显著降低细胞密度和细胞活率。这些可浸出物复杂多样，不止可以影响细胞活率，还可能影响乳酸脱氢酶的活性，进而导致乳酸的积累，以及中后期ph下降严重，补碱量加大，从而导致细胞状态不佳影响表达量和抗体质量。由于目前基本没有文献报道其影响机理，溶出析出也无法检测具体成分，实际开发过程中无从下手。成了目前许多项目的卡脖子环节，目前未发现文献介绍比较可靠的方法，急需成熟解决的方法。

3、根据一次性耗材析出物导致动物细胞乳酸积累的现象，现有技术中主要通过以下两种方法进行解决。一是宿主细胞改造，根据乳酸代谢的机理通过下调ldh-a的含量可以有效降低细胞培养过程中乳酸的积累，这点在众多的文献中均已得到证实。soomin noh等在gs筛选体系中运用shrna技术构建了低表达ldh的细胞株cho-k1 ldhsi、gsko ldhsi，与对照细胞组cho-k1、gs ko相比，其乳酸的累积明显降低(soo min noh,jinhyoungpark,myungsin lim,jong won kim,gyun min lee.reduction of ammonia and lactate throughthe coupling of glutamine synthetase selection and downregulation of lactatedehydrogenase-a in cho cells[j].applied microbiology and biotechnology,2017,101(3))。二是添加二价金属盐，sen xu等在ambr 15微反应器中进行了相关实验，其在基础培养基中添加了不同浓度的硫酸铜溶液(1×至200×)，并在d4和d6分别进行了补糖操作。结果显示，通过比较d4和d6补糖后硫酸铜实验组和对照组间细胞密度与乳酸含量的变化，可知铜离子的添加可促进细胞对乳酸的消耗及细胞生长(sen xu,lindahoshan,haochen.improving lactate metabolism in an intensified cho culture process:productivity and product quality considerations[j].bioprocess and biosystemsengineering,2016,39(11))。

4、对于宿主细胞改造法，下调ldh表达量理论上不会影响单抗的产量，soo团队在对单抗的质量属性分析中发现ldh下调不会影响到聚体与电荷异质性，但对糖基化具有影响，因此并不推荐在gs系统中实行下调ldh的基因工程技术，因其会影响到gs系统的筛选能力；还有一点也是值得注意的，完全的ldh基因去除对cho细胞是致命的。对于二价金属盐添加法，铜等二价离子的加入可能扩大了线粒体的氧化容量，从而降低了乳酸的累积，同时影响到单抗的质量，如增加碱性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。如何在减少耗材析出物引起细胞乳酸累积的同时，避免影响单抗产物的质量，是我们需要解决的一个问题。

技术实现思路

1、本公开提供一种降低耗材对培养细胞毒性的方法及应用。根据对细胞具有毒性的耗材溶出物作用机理，通过添加硫酸铜、以半乳糖部分替代葡萄糖、提高通气量相结合的方式促进对乳酸的消耗、减少乳酸的生成、增加乳酸和溶出物的挥发、提高有氧氧化的水平。另外，偏酸性的ph值并不能减少乳酸的产生，反而增加对cho细胞的损伤，因此维持中性ph值更有利于cho细胞的生长和外源重组蛋白(如抗体)的表达。具体而言：

2、一方面，本发明提供一种降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，包括：在动物细胞培养基中添加硫酸铜溶液，其特征在于，所述添加后培养基中铜离子的浓度可以减少乳酸的累积，且不会影响细胞产生抗体的表达量。

3、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，所述培养基中铜离子的浓度为0.05μm。

4、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，所述硫酸铜溶液的浓度为50μm。

5、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，所述硫酸铜溶液的添加量为培养基体积的0.1％。

6、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，在所述培养基中使用与葡萄糖/果糖相比更难以利用的单糖替代或部分替代葡萄糖/果糖。

7、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，所述动物细胞培养基中葡萄糖/果糖的浓度维持在1.0-3.5g/l，所述更难以利用的单糖为浓度3g/l的半乳糖。

8、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，将培养基ph维持于6.95±0.15的中性范围内，级联co2和1m的na2co3溶液调节ph。

9、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，do值40％，初始培养温度36.8℃，初始底部(t-sp)空气量恒通5l/min。

10、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，检测细胞密度达到9.0×106cells/ml后，降温至33℃。

11、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，培养至第8天后，底部通气量增加至10l/min。

12、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，采用分批补料工艺进行培养。

13、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，培养至第3天、第6天、第9天，均添加10％初始培养量的流加液c(cd efficientfeed c)。

14、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，培养至第4天、第5天、第7天、第8天、第10天、第11天、第12天、第13天，均添加1.5％初始培养量的流加液g(feed g、半乳糖、氯化锰)，和0.5％初始培养量的流加液h(l-半胱氨酸盐酸盐一水物、l-酪氨酸)。

15、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法，其特征在于，初始培养基体积为1300l。

16、进一步，本发明所述降低耗材析出物对培养的动物细胞产生不良影响的方法在培养重组细胞、生成重组单克隆抗体中的应用。

17、为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

18、在此使用的术语“细胞培养基”和“培养基”指的是含有滋养生长的动物细胞，例如，哺乳动物细胞的养分的溶液，并且也指的是与细胞结合的培养基。

19、优选的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞。本领域技术人员周知通过基因工程改造的细胞和/或细胞系表达感兴趣的蛋白质的方法和载体。基因工程技术包括，但不限于表达载体、定向同源重组和基因激活。可选地，该蛋白质在异源调控元件，比如，在自然界中不引导多肽生产的启动子，的控制下表达。例如，该启动子可以为引导哺乳动物多肽表达的病毒型强启动子(例如，cmv，sv40)。该宿主细胞通常可以或不可以生产蛋白质。例如，该宿主细胞可以为cho细胞，该cho细胞通过基因改造产生蛋白质，意味着编码该蛋白质的核酸已经导入该cho细胞中。

20、在此使用的术语“乳酸”，哺乳动物细胞生长期间产生的副产物，对细胞有潜在的毒性。乳酸累积影响培养基的缓冲能力，导致ph下降。应该看到乳酸不仅对细胞生产和生产率有副作用，而且对产物总体质量也有副作用。已经尝试几种方法减少培养基中的乳酸累积。该方法包括使细胞在低葡萄糖浓度下生长、使丙酮酸脱羧酶过度表达和敲除乳酸脱氢酶-a(ldh-a)基因。

21、在此使用的术语“抗体”包括抗体或抗体衍生物，或其片段，并且抗体的说明也适用于本发明的抗体的制备。在抗体的片段中，功能相当或同源的抗体包括含有免疫球蛋白结合结构域的多肽或摹拟该结合结构域，以及fc区或与fc区或至少部分fc区同源的区的肽。也包括与另一多肽融合的、含有免疫球蛋白结合结构域，或等同物的嵌合分子。

22、典型的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有抗体决定簇的部位，包括被称为fab、fab'、f(ab')2、fc和f(v)，以及n-多糖结构的这些部位。抗体描述了血清的功能成分并且通常指的是许多分子(抗体或免疫球蛋白，片段等等)或一种分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能与特定的抗原决定簇(抗原或抗原表位)结合或反应，这反过来可以诱导免疫效应机制。单独的抗体分子通常被看成是单一特异性的并且抗体分子的组合物可以是单克隆的(即，由相同的抗体分子组成)或多克隆的(即，由与相同抗原上或有差别的不同的抗原上相同或不同表位反应的不同的抗体分子组成)。组成多克隆抗体的差别的和不同的抗体分子可以称为“成员”。每种抗体分子具有能使其特异性结合至该分子相应的抗原的唯一的结构，并且所有的天然抗体分子具有两条相同的轻链和两条相同的重链的相同的整体基本结构。

23、本发明取得了以下有益的技术效果：

24、第一、针对耗材对培养细胞毒性的机理和产生的结果，采用降低乳酸的方法来解决选择、更换耗材导致的步入动物细胞培养状态不良、重组蛋白(例如抗体)产量低下的技术问题。

25、第二、针对现有技术中降低哺乳动物细胞培养中乳酸产生的方法在哺乳动物细胞重组表达目的蛋白中的缺陷，从乳酸产生底物、产生速度、利用速度、挥发速度等多方面为指标，优化培养条件，提出了以添加硫酸铜、以半乳糖部分替代葡萄糖、提高通气量相结合的技术方案。

26、第三、现有技术中细胞最佳生长ph值为近中性或偏碱性，为了降低乳酸产量，现有技术通常采用偏酸性的ph值。发明人研究发现维持偏酸性的ph值对于减少乳酸产量实际上没有帮助，过多的h+反而对哺乳动物细胞产生较大的毒害作用，因此采用了6.95±0.15的ph值，克服了现有技术偏见。