一种甘草种子蛋白的超声波辅助制备方法及其用途

1.本发明涉及一种基于响应面法优化超声辅助制备甘草种子蛋白的方法及其用途。


背景技术：

2.甘草(glycyrrhizae)属豆科，多年生草本植物，是一种传统的补益中草药，应用较广泛，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛及调和诸药等多种功效。乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草作为药用甘草植物收载于《中国药典》。甘草的多种药理作用归因于其多种活性成分，包括三萜皂苷类、黄酮类、多糖类、香豆素类、生物碱类和蛋白质等多种功能成分。近年来，对甘草的开发利用基本集中在根和根茎上，但有关甘草种子化学成分的研究尚未深入开展。种子是遗传因子的载体之一，由遗传基因控制的蛋白质分子普遍存在于种子中，对植物的生长发育起着重要作用，并且种子蛋白具有多态性、特异性及稳定性等优点。
3.蛋白质是由多种氨基酸通过肽键彼此连接的具有一定空间结构的生物大分子，广泛存在于动物与植物体内，是组成机体一切细胞、组织的重要成分。植物蛋白是指植物体内各种氨基酸组成的具有特定空间结构的高分子聚合物。传统的营养学观点一般认为植物蛋白的营养价值不如动物蛋白，但随着生活水平的提高，与饮食有关的“文明病”出现上升势头，人们逐渐意识到以低脂肪和低胆固醇为特点的植物蛋白质更易于人体吸收，具有一定降胆固醇、抗高血压和抗肿瘤的功效。研究表明，甘草的根和叶子部位均含有丰富的蛋白质，并测得甘草中氨基酸种类多达18种，人体必需氨基酸含量达到62.87mg/ml，其中苏氨酸含量最高，为23.23mg/ml，苏氨酸作为必需氨基酸，能够参与氨基酸平衡，在合成蛋白质中起促进作用。蛋白质是种子类植物富含的成分之一，因此，甘草种子有望成为一种优质蛋白质来源，具有较高的研究价值。
4.植物蛋白的原材料来源广泛和廉价易得，且具有极好的药理活性，由于多肽类药物具有活性强、特异性高、毒性较弱，在体内不易蓄积，较少与其他药物发生相互作用等独特优势，在临床上被广泛应用，在不久的将来越来越多的药物可能会不断被多肽类药物所取代，并逐步变成众多领域的重要研究方向。目前，有关甘草蛋白成分的研究较少，并且均集中在其根、茎和叶等部位，极少使用甘草种子。以往的研究结果表明，甘草根多糖也具有较高的抗氧化活性，当样品浓度达到1mg/ml时，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基清除率约为83％。此外，最新研究发现三种甘草种子多糖的体外抗氧化活性均高于其根部多糖，并且与蛋白质结合的多糖可以增强分子的负电荷，能够更好地稳定自由基，阻止氧化反应。借此，初步判断为甘草的种子蛋白具有较强的体外抗氧化活性，因此，从甘草种子中提取天然抗氧化肽对甘草种子的开发和利用意义重大。
5.传统的热水提取甘草蛋白的方法用时较长，可能会造成损失部分蛋白，使产率下降，并影响其活性。而超声波辅助提取法能够以极大压力破坏原料细胞的细胞壁，使植物细胞内的有效成分快速地进入溶剂中，得到混合提取液，从而提高提取率。超声波辅助提取甘草种子蛋白，操作简便，耗时较短，得率高，且其提取温度较低，可以避免因温度高而破坏水
溶性蛋白的生物活性，并具有能耗少、节约资源等多种优点。


技术实现要素：

6.本发明目的在于，提供一种甘草种子蛋白的制备方法及其用途，该方法以药用甘草种子为原料，采用碱提酸沉超声波辅助提取结合响应面优化法制备其蛋白，将甘草种子粉碎、并过筛分离杂质后石油醚脱脂，待其自然风干后，以碱溶液为溶剂进行提取，再进行酸沉、水洗沉淀，经冷冻干燥制成甘草种子蛋白粉末。采用响应面法进行优化，以超声功率、超声时间、超声温度及料液比作为影响因素，设计四因素三水平的响应面分析试验，确定甘草种子蛋白的超声功率300w、超声时间36min、超声温度45℃、料液比1:40g/ml，在此条件下，甘草种子蛋白平均含量达到110.47mg/g，与预测值110.172mg/g相近，充分说明该工艺参数准确可靠，具有实用价值。甘草种子蛋白的红外光谱均显出了典型的蛋白吸收峰，具有α螺旋结构；扫描电镜图像结果显示，其呈现出不规则的块状和厚薄较均匀的片状结构，同时该蛋白被验证具有一定的抗氧化活性。本发明可为甘草种子的开发利用及其抗氧化肽的制备提供参考。
7.本发明所述的一种甘草种子蛋白的超声波辅助制备方法，按下列步骤进行：
8.a、称取甘草种子进行粉碎、过60目筛、分离杂物，获得甘草种子粉末；
9.b、将步骤a中得到的粉末按w/v＝1:10加入石油醚，放置于摇床振摇2h，反复3-4次，抽滤，室温干燥至未有石油醚溶剂残留，得到甘草种子脱脂粉末；
10.c、运用design expert 8.0.6软件进行box-behnken响应面优化设计，以蛋白含量为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法优化，在超声功率300w、超声时间36min、超声温度45℃、料液比1:40g/ml的条件下，得到甘草种子蛋白的提取液；
11.d、将步骤c中得到的提取液在4000rpm下离心10min，取上清液，用0.1mol/l盐酸溶液滴定至等电点、再离心、取沉淀；
12.e、将步骤d中得到的沉淀水洗至中性，置于冷冻干燥机内进行干燥，即得到甘草种子蛋白。
13.所述方法获得的甘草种子蛋白在制备抗氧化保健品中的用途。
附图说明
14.图1为本发明超声功率对甘草种子蛋白含量的影响；
15.图2为本发明超声时间对甘草种子蛋白含量的影响；
16.图3为本发明超声温度对甘草种子蛋白含量的影响；
17.图4为本发明液料比对甘草种子蛋白含量的影响；
18.图5为本发明超声功率与超声时间交互作用影响；
19.图6为本发明超声功率与超声温度交互作用影响；
20.图7为本发明超声功率与料液比交互作用影响；
21.图8为本发明甘草种子蛋白红外光谱图；
22.图9为本发明甘草种子蛋白红外光谱图；
23.图10为本发明甘草种子蛋白清除dpph自由基(dpph
·
)能力图；
24.图11为本发明甘草种子蛋白清除羟基自由基(
·
oh)能力图；
25.图12为本发明甘草种子蛋白清除abts自由基(abts
·
)能力图；
26.图13为本发明甘草种子蛋白清除o
2-自由基(o
2-·
)能力图；
27.图14为本发明甘草种子蛋白总还原能力图。
具体实施方式
28.实施例1
29.a、称取甘草种子2.0g进行粉碎、过60目筛、分离杂物，获得甘草种子粉末；
30.b、将步骤a中得到的粉末按w/v＝1:10加入石油醚，放置于摇床振摇2h，反复3次至石油醚层透明为止，抽滤，室温干燥至未有石油醚溶剂残留，得到甘草种子脱脂粉末；
31.c、运用design expert 8.0.6软件进行box-behnken响应面优化设计，以蛋白含量为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法优化，在超声功率300w、超声时间36min、超声温度45℃、料液比1:40g/ml的条件下，得到甘草种子蛋白的提取液；
32.d、将步骤c中得到的提取液在4000rpm下离心10min，取上清液，用0.1mol/l盐酸溶液滴定至等电点、再离心、取沉淀；
33.e、将步骤d中得到的沉淀水洗至中性，置于冷冻干燥机内进行干燥，即得到甘草种子蛋白。
34.实施例2
35.a、称取甘草种子2.0g进行粉碎、过60目筛、分离杂物，获得甘草种子粉末；
36.b、将步骤a中得到的粉末按w/v＝1:10加入石油醚，放置于摇床振摇2h，反复4次至石油醚层透明为止，抽滤，室温干燥至未有石油醚溶剂残留，得到甘草种子脱脂粉末；
37.c、运用design expert 8.0.6软件进行box-behnken响应面优化设计，以蛋白含量为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法优化，在超声功率300w、超声时间36min、超声温度45℃、料液比1:40g/ml的条件下，得到甘草种子蛋白的提取液；
38.d、将步骤c中得到的提取液在4000rpm下离心10min，取上清液，用0.1mol/l盐酸溶液滴定至等电点、再离心、取沉淀；
39.e、将步骤d中得到的沉淀水洗至中性，置于冷冻干燥机内进行干燥，即得到甘草种子蛋白。
40.实施例3
41.本发明所述的一种甘草种子蛋白的超声波辅助制备方法及用途，该方法中采用响应面法优化甘草种子蛋白提取工艺：
42.以单因素试验为基础，利用design-expert 8.0.6软件的box-behnken方法进行试验设计，以甘草种子蛋白含量为响应值，得到最佳提取条件；
43.1.单因素试验：
44.称取甘草种子脱脂粉末2.0g，置于50ml圆底烧瓶中，超声波辅助提取甘草种子蛋白，分别考察超声功率、超声时间、超声温度及料液比对甘草种子蛋白含量的影响，单因素试验水平表见表1；
45.表1单因素试验水平表
50℃时，蛋白含量呈上升趋势，并且在50℃时达到最高值为63.18mg/g。但当温度超过50℃时，蛋白含量逐渐降低；在提取过程中过高的温度会导致蛋白结构的破坏，影响生物活性；因此，提取温度选择40-60℃为响应面优化区间；
58.d：液料比
59.如附图4所示，随着液料比的增加，甘草种子蛋白的提取率呈现先递增后递减的趋势，在料液比为1:40g/ml时，蛋白含量达到最高值为101.23mg/g；而继续增加液料比会使料液过于分散，不利于后期蛋白质沉淀，从而导致蛋白含量降低。因此，液料比选择1:30-1:50g/ml为响应面优化区间；
60.4、响应面优化结果：
61.根据box-behnken原理设计试验，将甘草种子蛋白含量作为响应值，按照单因素实验的结果，以功率、时间、温度和料液比为主要因素，建立4因素3水平响应面试验，共有29个试验点，其中24个为析因子，5个为零点，并计算其蛋白含量结果见表3；
62.表3 box-benhnken试验设计方案及结果
[0063][0064][0065]
利用design-expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，并拟合响应值与各因素的数学回归模型，甘草种子蛋白提取工艺蛋白含量(y)对4个因素(a、b、c、d)的二次回归
模型方程：y＝107.10+0.43a-7.36b-8.92c+0.70d+1.79ab+1.48ac-5.47ad-0.31bc+2.42bd+1.31cd-20.82a2-11.10b2-10.54c2-15.61d2，见表4
[0066]
表4方差分析结果
[0067][0068]
注：r2＝0.9961；校正决定系数r
2adj
＝0.9922.
[0069]
由表4可知，该模型回归极显著(p《0.0001)，失拟项不显著(p》0.05)，r2＝0.9873，r
2adj
＝0.9922，说明该模型方差分析表明方程对试验拟合情况较好，方法可靠，因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。该模型中，b、c、a2、b2、c2、d2、ad，p值均小于0.01，均表现为极显著，ab、ac、bd，p值均小于0.05，表现为显著，表明上述因素对响应值影响较大；而a、d、bc、cd，p值均大于0.05，表现为不显著。因此，各个单因素对甘草蛋白含量的影响不是简单的线性关系。根据表4中各项的f值大小，可知影响超声波提取甘草种子蛋白的4个因素影响程度从大到小依次为：超声温度(c)＞超声时间(b)＞料液比(d)＞超声功率(a)；
[0070]
采用design-expert 8.0.6软件，得到超声功率(a)、超声时间(b)、超声温度(c)和
料液比(d)之间的综合评分响应曲面图，各因素交互作用见附图5-7；
[0071]
5、验证试验：
[0072]
根据所得到的模型，分析得出在试验范围内甘草种子蛋白最佳工艺条件为：超声功率298.42w、超声时间36.71min、超声温度45.80℃、料液比1:39.82g/ml。考虑到实际操作的便利性，调整提取工艺条件为：超声功率300w、超声时间36min、超声温度45℃、料液比1:40g/ml，进行三次平行实验。在此条件下，甘草种子蛋白平均含量为110.47mg/g，非常接近预测值110.172mg/g，表明采用的响应面优化法参数可靠准确。
[0073]
本发明所述的一种甘草种子蛋白的制备方法，其基于响应面法优化超声辅助提取，具有操作简便，耗时较短，得率高，能耗少、节约资源等多种优点。该蛋白部位被验证具有抗氧化活性，总还原能力及对dpph、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，abts)和超氧阴离子(superoxide anion，o
2-)等自由基的清除能力较强。本发明可为甘草种子蛋白在抗氧化功能性食品中的应用开发提供参考。
[0074]
实施例4
[0075]
通过本发明所述方法获得的甘草种子蛋白，经红外光谱图测试：
[0076]
红外图谱图8显示，甘草种子蛋白在4000-400cm-1
之间呈现出蛋白类化合物的特征吸收，在3369.88cm-1
附近均出现强吸收峰，是典型的因n-h伸缩振动形成的酰胺a带的特征峰；出现在2926.94cm-1
附近出现的吸收峰是因c-n伸缩振动引起的酰胺b带的特征峰，是酰胺ⅱ带的一次泛频；在氨基酸之间存在大量肽键，c＝0的伸缩振动会导致酰胺ⅰ的特征吸收峰位于1700-1600cm-1
处，甘草种子蛋白在1654.32cm-1
处有吸收峰，说明具有α螺旋结构。1535.21cm-1
处吸收，是conh基团c＝o键伸缩振动，是肽键的特征吸收峰；甘草种子蛋白在1443.65cm-1
处出现的吸收峰是由n-h面内弯曲振动引起的酰胺ⅱ带的特征峰，而1388.81cm-1
处的吸收峰是因c-n伸缩振动引起的酰胺ⅲ带，酰胺ⅲ的存在证实了甘草种子蛋白三螺旋结构的完整；
[0077]
表5甘草种子蛋白红外光谱峰位及解析
[0078][0079]
扫描电镜图：
[0080]
蛋白类生物大分子常用扫描电镜(sem)研究表面形态结构；sem图9显示，可见甘草种子蛋白在放大800倍的情况下呈现出不规则的块状和厚薄较均匀的片状结构状态，表面稍粗糙，是典型的蛋白结构形态。
[0081]
实施例5
[0082]
通过本发明所述方法获得的甘草种子蛋白对dpph
·
的清除能力：
[0083]
将甘草种子蛋白样品分别配成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的溶液，分别准确取2ml不同浓度的样品溶液和2ml 0.2mmol/l的dpph溶液于试管中，等体积的无水乙醇代替dpph溶液，室温避光反应30min，在波长517nm处测吸光度，平行测定3次；以相应浓度梯度的vc溶液做阳性对照，无水乙醇溶液作为空白。清除率按下面公式计算，并计算出ic
50
：
[0084][0085]
式中a0、a1、a2分别代表空白组、样品组及对照组的吸光度；
[0086]
甘草种子蛋白对
·
oh的清除能力：
[0087]
将甘草种子蛋白样品配成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的溶液，依次加入1.0ml 6mmol/l feso4溶液和1.0ml 6mmol/l水杨酸-乙醇溶液，摇匀后再加入1.0ml 6mmol/l h2o2溶液启动反应体系，于温度37℃水浴反应30min，在510nm处测定吸光度，平行测定3次，以相应浓度梯度的vc溶液做阳性对照，蒸馏水作为空白，清除率按下面公式计算，并计算出ic
50
：
[0088][0089]
式中a0、a1、a2分别代表空白组、样品组及对照组的吸光度；
[0090]
甘草种子蛋白对abts
·
的清除能力：
[0091]
按体积比1:1将7mmol/l 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，abts)溶液与2.45mmol/l过硫酸钾溶液混合，室温避光反应16h，用无水乙醇将abts储备液稀释为734nm处吸光值0.70
±
0.02，配置浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的甘草种子蛋白溶液，分别精确移取0.4ml配置不同浓度的样品溶液和3.6ml配置好的abts自由基溶液于试管中，室温避光反应6min，于734nm测定吸光度，平行测定3次，以相应浓度梯度的vc溶液做阳性对照，蒸馏水作为空白，清除率按下面公式计算，并计算出ic
50。
[0092][0093]
式中a0和a1分别代表空白组和样品组的吸光度；
[0094]
甘草种子蛋白对o
2-·
的清除能力：
[0095]
移取2ml三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)缓冲溶液50mmol/l，ph＝8.2于试管中，分别加入1ml 0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml浓度的甘草种子蛋白溶液，于温度25℃水浴反应15min，再加入1ml 6mmol/l邻苯三酚充分混匀，于温度25℃水浴反应5min，反应后再加0.1ml 10mol/l盐酸溶液终止反应，320nm处测定吸光度，平行测定3次，以相应浓度梯度的vc作阳性对照，蒸馏水作为空白。清除率按下面公式计算，并计算出ic
50
；
[0096][0097]
式中a0和a1分别代表空白组和样品组的吸光度；
[0098]
甘草种子蛋白总还原能力：
[0099]
将甘草种子蛋白样品配成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的溶液，各取0.8ml加入0.4ml pbs溶液和0.4ml 1％铁氰化钾水溶液，于温度50℃水浴下反应20min，降至室温，加入0.4ml 10％三氯乙酸水溶液、1.6ml蒸馏水和0.4ml 0.1％三氯化铁水溶液，室温放置10min，于700nm处测吸光度。
[0100]
通过本发明所述方法获得的甘草种子蛋白对dpph
·
、
·
oh、abts
·
和o
2-·
的清除率及总还原能力如图10-14所示；甘草种子蛋白清除dpph
·
、
·
oh、abts
·
和o
2-·
的ic
50
值分别为0.428、1.794、0.042和1.907mg/ml，对
·
oh与o
2-·
的清除率略低于其余两种；当甘草种子蛋白溶液浓度为1mg/ml时，总还原力为最大值2.473，说明甘草种子蛋白具有良好的还原能力。
[0101]
本发明所述方法得到的甘草种子蛋白具有较强的清除自由基的能力，因此，甘草种子有望作为一种优质蛋白质来源，代替甘草根入药，来实现充分利用甘草各个部位，节省甘草资源，进而实现变废为宝。同时，超声辅助法具有能耗小、所需时间短、节省、环保等优点。因此，通过响应面优化超声波辅助提取甘草种子蛋白能够得到活性更高的蛋白成分。可为甘草种子蛋白在抗氧化保健品中的应用提供参考。