一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用

1.本发明涉及诺丽果化学领域，特别涉及一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用。


背景技术：

2.诺丽(morindacitrifolia)又名海巴戟，为茜草科(rubiaceae)海巴戟天属(morinda)的常绿灌木或小乔木，集中分布于热带、亚热带地区，在我国主要分布于海南岛、西沙群岛和台湾岛等地。《本草纲目》记载，“海巴戟”具有“扶正祛邪，滋阴补肾、壮阳，祛风湿、治冷宫不孕、治阳痿”之功。诺丽果是一种具有独特保健作用的聚花果，由其发酵产生的原汁(诺丽酵素)为广受欢迎的保健饮品，具有降三高(高血糖、高血压、高血脂)、抗肿瘤等功效。
3.研究报道诺丽果的化学成分主要为苯丙素(苷)类、黄酮(苷)类、二萜、三萜、环烯醚萜类、酚酸类等类型化合物，且都具有较好的生物活性。关于诺丽种子的化学成分研究报道较少。本发明旨在对诺丽种子化学成分研究，以期得到具有显著降血糖作用的新结构化合物，充分挖掘诺丽这一保健水果的药用价值。
4.专利cn202110344488.x不饱和脂肪酸类化合物及其制备方法和应用，从红背山麻杆中提取不饱和脂肪酸类化合物，该化合物具有加强神经细胞分化功能，没有说明本发明中不饱和脂肪酸类化合物对α
‑
葡萄糖苷酶的抑制作用。专利不饱和脂肪酸化合物及其制备方法和应用，该申请从从海洋真菌aspergillus sp.gdmcc 61218的发酵液中分离得到，这类不饱和脂肪酸化合物具有明显的抑制植物病原真菌活性，可用于制备抗植物病原真菌农药，该申请没有说明本发明中不饱和脂肪酸类化合物对α
‑
葡萄糖苷酶的抑制作用。因此本发明提出一种从诺丽果种子中提取得到具有抑制α
‑
葡萄糖苷酶作用的不饱和脂肪酸类化合物。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种新结构的不饱和脂肪酸类化合物，具有较好的α
‑
葡萄糖苷酶抑制作用，并提供目标化合物的分离方法。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.包括以下步骤：
8.(1)将诺丽种子粉碎，制得诺丽种子粉末，加入石油醚超声提取，料液比为1kg：4～5l，提取次数为3～6次，提取时间为1～3h，合并提取液，将提取液减压浓缩制得浸膏；
9.(2)将步骤(1)制得的浸膏，使用硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，制得洗脱组分1，即得fr.1～6组分；
10.(3)将fr.2组分先使用正相硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，得到洗脱组分2，将洗脱组分2减压浓缩后，再经凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿和甲醇混合液，得到洗脱组分3，将洗脱组分3减压浓缩后再经高效液相色谱仪制备，得到不饱和脂肪酸类化
合物i。
11.进一步的，步骤(1)中，所述超声频率为30～50khz，超声时间每次15
‑
30min。
12.进一步的，步骤(2)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为100～1:1。
13.进一步的，步骤(3)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为20～1:1，所述氯仿和甲醇体积比为5:1。
14.进一步的，步骤(3)中，所述凝胶柱型号为sephadex lh
‑
20。
15.进一步的，所述洗脱剂洗脱体积为3～6个柱体积。
16.进一步的，步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为c
18
(100
×
2.1mm，1.7μm)，流速为2ml/min，流动相为体积比40:60的乙腈和水。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.本发明从诺丽种子中提取分离出不饱和脂肪酸类化合物i，具有良好的α
‑
葡萄糖苷酶抑制作用。进一步的，本发明通过极性溶剂浸提、溶剂梯度洗脱和液相色谱分离等多级分离提取方法，从诺丽种子中得到该不饱和脂肪酸类化合物。
附图说明
19.图1：化合物i的1h
‑
nmr谱(meod
‑
d4)
20.图2：化合物i的
13
c
‑
nmr谱(meod
‑
d4)
21.图3：化合物i的dept(135
°
)谱(meod
‑
d4)
22.图4：化合物i的1h
‑1h cosy谱(meod
‑
d4)
23.图5：化合物i的hsqc谱(meod
‑
d4)
24.图6：化合物i的hmbc谱(meod
‑
d4)
25.图7：化合物i的hresims谱
26.图8：化合物i结构图
具体实施方式
27.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
28.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
29.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1诺丽果种子洗脱组分1的制备方法
31.(1)将诺丽种子粉碎，制得诺丽种子粉末，加入石油醚超声提取，超声频率为40khz，超声时间每次20min，料液比为1kg：4l，提取次数为4次，提取时间为2h，合并提取液，将提取液减压浓缩制得浸膏；
32.(2)称取50g步骤(1)制得的浸膏，使用硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为100:1、70:1、30:1、10:1、5:1、1:1进行洗脱，每个梯度收集3个柱体积，每个梯度得到一个组分，共得到6个组分，即组分1～6。
33.使用高效液相色谱仪检测含量，色谱条件为检测条件：
34.检测波长220nm；
35.色谱柱：waters c
18
(100
×
2.1mm，1.7μm)；
36.进样体积：2μl；
37.流动相a：乙腈；流动相b：0.1％甲酸水；
38.洗脱梯度：(0～4min，5％～15％a；4.01～12min，15％～25％a；12.01～18min，25％～40％a；18.01～23min，40％～90％a；23.01～25min，90％～5％a)
39.体积比100:170:130:110:15:11:1含量(％)40.3743.1941.3139.1237.6135.13
40.实验结果表明，本发明中采用石油醚和乙酸乙酯体积比为70:1洗脱得到的不饱和脂肪酸类化合物含量最高。
41.实施例2诺丽果种子洗脱组分2的制备方法
42.将实施例1得到的洗脱组分2使用正相硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为100:1、70:1、30:1、10:1、5:1、1:1进行洗脱，收集各梯度洗脱组分进行检测。
43.检测条件同实施例1
44.体积比20:110:130:15:11:1含量(％)60.1365.1258.4253.1154.62
45.实验结果表明，本发明中使用正相硅胶柱层析，采用石油醚和乙酸乙酯体积比为10:1洗脱得到的不饱和脂肪酸类化合物含量最高。
46.实施例3诺丽果种子不饱和脂肪酸类化合物的制备方法
47.将实施例2得到的洗脱组分2进行减压浓缩，再经sephadex lh
‑
20凝胶柱层析，洗脱剂由体积比为1:1的氯仿和甲醇制得，洗脱量为4个柱体积，得到洗脱组分3，将洗脱组分3减压浓缩后再经高效液相色谱仪制备，色谱条件为：waters c
18
色谱柱，流速为2ml/min，流动相为体积比40:60的乙腈和水，得到不饱和脂肪酸类化合物i。
48.试验例1不饱和脂肪酸类化合物的结构鉴定
49.运用波谱(1h nmr，
13
c nmr，hsqc，hmbc，noesy)和ms等现代结构鉴定技术，确定实施例3不饱和脂肪酸类化合物i的化学结构。
50.结构鉴定数据如下：化合物i为无色油状物，易溶于甲醇。经高分辩质谱hresi(
‑
)ms(m/z181.0860[m
‑
h]
‑
，理论值181.0865)确定其分子式为c
10
h
14
o3；根据1h，
13
c及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为不饱和脂肪酸。由于分子中只含有一个手性中心，经测定化合物i的旋光值为((c 0.10,meoh)，对照文献数据，碳9位构型为s。因此，化合物鉴定为(s,2e,4z,7z)
‑9‑
羟基十碳
‑
2,4,7
‑
三烯酸[(s,2e,4z,7z)
‑9‑
hydroxydeca
‑
2,4,7
‑
trienoic acid]，将其命名为moricitacid a，其1h和
13
cnmr数据归属见表1。
[0051]
表1.化合物i的1h
‑
nmr(400mhz)和
13
c
‑
nmr(100mhz)数据
[0052][0053]
经以上分析，确定化合物i结构，参见图8。
[0054]
试验例2药理活性实验
[0055]
实验材料：
[0056]
96孔板、恒温培养箱、酶标仪(elx800)、恒温振荡器、阿卡波糖(acarbose)、α
‑
葡萄糖苷酶、对硝基酚、对硝基苯
‑
α
‑
d
‑
葡萄糖苷
[0057]
实验方法：
[0058]
按要求配制好底物pnpg溶液，0.2mol/l的na2co3溶液，α
‑
葡萄糖苷酶的酶溶液，以阿卡波糖标准溶液为抑制剂。
[0059]
依次取已制备的50μl磷酸盐缓冲液(ph 6.8)，20μl化合物i(终浓度分别为0.6,0.3,0.15,0.0725mg
·
ml
‑1)，10μlα
‑
葡萄糖苷酶(1.0u
·
ml
‑1)，20μl2.5mmol
·
l
‑1底物(对硝基苯基
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷)溶液，混匀后在37℃下孵育15分钟，然后加入150μl na2co3溶液终止反应。供试品混合均匀后在405nm波长处测定吸光度(a)值，即在酶的作用下底物释放出的硝基酚量。平行测定3次，取平均值。按下式计算样品对α
‑
葡萄糖苷酶的抑制率：
[0060]
抑制率(％)＝[1
‑
(a405nm sample
‑
a405nm blank)/a405nm control]
×
100
[0061]
式中，a405nm sample表示样品的a值，a405nm blank表示空白的a值(排除样品和酶的干扰)，a405nm control表示排除样品干扰的a值。
[0062]
化合物的α
‑
葡萄糖苷酶抑制作用的结果如表2所示，从实验结果可知，化合物i表现出较好的α
‑
葡萄糖苷酶抑制效果，ic
50
为243μm。
[0063]
表2化合物i的α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性
[0064]
化合物ic
50
/μmi243
a
acarbose135.4
[0065]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。