一种冠状病毒质控品稀释液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及检测技术领域，特别是涉及一种冠状病毒质控品稀释液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.为保证新冠病毒核酸检测质量可控，保证检测数据的准确性和精密度，在日常检测过程中需室内质控品实时质量控制。目前市场上应用较多且有正式批准文号(有三证)的新冠病毒核酸检测质控品是邦德盛假病毒。由于邦德盛假病毒质控品每一批次的拷贝数不一致，且质控品浓度往往超出实际使用需求。因此，在应用中各实验室会根据不同新冠核酸检测试剂盒的检测下限设置，将液体质控品进行相应倍数稀释后使用。然而在日常实验过程中发现，稀释后的质控存放不同温度和时间对结果影响很大。


技术实现要素：

3.针对上述技术问题，本发明提供一种冠状病毒质控品稀释液，该稀释液使冠状病毒质控品在不同稀释浓度、稀释后存放温度、存放时间、冻存后反复冻融的情况下，采用该稀释液稀释后均有较好的稳定性，有助于提高液体质控品存放温度、存放时间的适用范围，避免实际操作中因室内质控结果异常而影响检验结果的准确性和报告的出具时间。
4.本发明提供了一种冠状病毒质控品稀释液，该稀释液包括：缓冲液、rna酶抑制剂、病毒代谢抑制剂、rna稳定剂和抑菌剂；所述rna稳定剂包括：edta、hepes、亚硫酸钠和辛酸钠。
5.采用上述原料，具有能保护核酸的完整性和稳定性、抑制样本和环境中的rna酶活性，保证检测样本不被降解的优势。
6.在其中一个实施例中，所述rna稳定剂包括以下重量份比的原料：
[0007][0008]
采用上述重量份比的原料，保证稀释液中阴阳离子平衡，rna分子外电荷、离子键、共价键稳态，具有能保护核酸的完整性和稳定性，使样本反复冻融后核酸的分子不断裂，保证质控样本不同贮存条件下结果稳定的优势。
[0009]
在其中一个实施例中，所述rna稳定剂的工作浓度为0.8-1.5mmo/l，ph值为6-8。
[0010]
采用上述工作浓度和ph值的rna稳定剂，对上述配制好的质控品具有长期存放及反复冻融核酸分子不断裂和质控品中的rna不被降解等优势。
[0011]
在其中一个实施例中，所述缓冲液包括电解质，所述电解质的工作浓度为2.8μmol/l-3mmol/l。
[0012]
在其中一个实施例中，所述电解质包括以下工作浓度的原料：
[0013][0014]
在其中一个实施例中，所述rna酶抑制剂包括工作浓度为2.5-3.5mmo/l的磷酸二羟丙酮。
[0015]
采用上述工作浓度的rna酶抑制剂，能使质控品中病毒的rna不在检测过程中被降解。
[0016]
在其中一个实施例中，所述病毒代谢抑制剂包括以下工作浓度的原料：
[0017]
氟化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5-1.5mmol/l
[0018]
亮抑酶酞
ꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5-1.5mmol/l。
[0019]
采用上述工作浓度的病毒代谢抑制剂可抑制质控品中的病毒裂解，使质控品保持原状态。
[0020]
在其中一个实施例中，所述抑菌剂包括工作浓度为0.5-1.5mg/l的芬母多肽。
[0021]
采用上述工作浓度的抑菌剂，可广谱抑制各种微生物的生长，同时对质控品的检测无干扰。
[0022]
本发明还提供了一种所述冠状病毒质控品稀释液的制备方法，包括以下步骤：
[0023]
制备缓冲液：称取电解质原料配制缓冲液；
[0024]
制备冠状病毒质控品稀释液：在所述缓冲液中加入rna酶抑制剂、病毒代谢抑制剂、辛酸钠混合均匀，得到第一混合物；称取edta、hepes、na2so3混合均匀，调节ph值，得到第二混合物；将所述第一混合物和所述第二混合物按重量份比1:1配合，混合，加入除菌剂，即得。
[0025]
在其中一个实施例中，所述rna稳定剂采用碳酸氢钠调节ph值。
[0026]
本发明还提供了一种冠状病毒质控品的保存方法，包括以下步骤：该冠状病毒质控品采用所述冠状病毒质控品稀释液稀释和保存。
[0027]
在其中一个实施例中，所述冠状病毒为冠状病毒covid-19。
[0028]
在其中一个实施例中，所述保存的温度选自零下20℃、4℃、15℃-25℃，所述保存时间≤21天。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030]
本发明提供了一种冠状病毒质控品稀释液及其制备方法和应用，该稀释液使冠状病毒质控品在不同稀释浓度、稀释后存放温度、存放时间、冻存后反复冻融的情况下，采用该稀释液稀释后均有较好的稳定性，有助于提高液体质控品存放温度、存放时间的适用范围，避免实际操作中因室内质控结果异常而影响检验结果的准确性和报告的出具时间。
附图说明
[0031]
图1为实验例中生理盐水不同稀释度稀释质控品的结果图。
[0032]
图2为实验例中生理盐水不同稀释度稀释质控品的荧光定量pcr检测fam通道
(orf1-ab基因)结果图。
[0033]
图3为实验例中生理盐水不同稀释度稀释质控品的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0034]
图4为实验例中冻融次数对质控品原液影响的结果图。
[0035]
图5为实验例中冻融次数对质控品原液影响的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0036]
图6为实验例中冻融次数对质控品原液影响的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0037]
图7为实验例中不同稀释液在不同稀释度下orf-1ab基因的基线检测结果图。
[0038]
图8为实验例中不同稀释液在不同稀释度下n基因的基线检测结果图。
[0039]
图9为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放0天的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0040]
图10为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放0天的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0041]
图11为实验例中质控品采用不同稀释液1:320稀释后存放于不同温度下1天后3种基因(ic、orf-lab、n基因)结果图。
[0042]
图12为实验例中质控品采用不同稀释液1:80稀释后存放于不同温度下21天后3种基因(ic、orf-lab、n基因)结果图。
[0043]
图13为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放不同时间的orf-lab基因结果影响图。
[0044]
图14为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放1天的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0045]
图15为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放3天的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0046]
图16为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放7天的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0047]
图17为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放14天的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0048]
图18为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放21天的荧光定量pcr检测fam通道(orf1-ab基因)结果图。
[0049]
图19为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放不同时间的n基因结果影响图。
[0050]
图20为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放1天的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0051]
图21为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放3天的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0052]
图22为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放7天的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0053]
图23为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放14天
的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0054]
图24为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放21天的荧光定量pcr检测vic通道(n基因)结果图。
[0055]
图25为实验例中质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放不同时间的ic基因结果影响图。
[0056]
图26实验例中为质控品采用生理盐水不同稀释倍数对3种基因结果影响图；图中每组基因从左到右依次为orf-ab基因、n基因、ic基因。
[0057]
图27实验例中为新型冠状病毒质控品原液反复冻融3次对3种基因结果影响图；图中每组基因从左到右依次为orf-ab基因、n基因、ic基因。
具体实施方式
[0058]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0059]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0060]
定义：
[0061]
本发明所述的edta：指乙二胺四乙酸。
[0062]
hepes：指4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0063]
芬母多肽：是一种抗菌肽，一种高活性氨基酸组合物，一种生物来源的天然杀菌消毒材料。
[0064]
来源：
[0065]
试剂：2019新型冠状病毒核糖核酸(2019-ncov rna)液体室内质控品(广州邦德盛生物科技有限公司，批号为2020012，编号为s2，均值为2.88e+04copies/ml，为6.23e+03～6.04e+04copies/ml)；邦德盛质控品稀释液(广州邦德盛生物科技有限公司提供)；生理盐水(双鹤药业，批号20011411c)；核酸提取或纯化试剂盒(湖南圣湘，批号a2021035)，新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)(湖南圣湘，批号2021046)。
[0066]
设备：purifier ht型96通道全自动核酸提取仪(北京济凡生物)；ma-6000型实时荧光定量pcr仪(苏州雅睿生物)。
[0067]
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
[0068]
实施例1
[0069]
制备一种冠状病毒质控品稀释液。
[0070]
1、制备缓冲液。
[0071][0072]
按照以上各化学试剂的工作浓度在分析天平上称取各试剂于1000ml烧杯中，加蒸馏水至400ml，溶解后得到缓冲液。
[0073]
2、制备冠状病毒质控品稀释液：在所述缓冲液中加入磷酸二羟丙酮、氟化钠和亮抑酶酞；溶解后加入辛酸钠，补充蒸馏水至500ml，蒸汽高压灭菌得到第一混合物；
[0074]
在分析天平上称取edta(乙二胺四乙酸)、hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、na2so3(亚硫酸钠)于1000ml烧杯中，加蒸馏水至400ml，用nahco3(碳酸氢钠)调至ph7.2后补充蒸馏水至500ml，得到第二混合物；
[0075]
将所述第一混合物和所述第二混合物按重量份比1:1配合，混合，加入芬母多肽，即得。
[0076]
配置完成后，所述磷酸二羟丙酮的工作浓度为3mmo/l，所述氟化钠的工作浓度为1mmo/l，所述亮抑酶酞的工作浓度为1mmo/l，所述辛酸钠的工作浓度为16mmol/l，所述edta的工作浓度为0.745g/l，所述hepes的工作浓度为1.500g/l，所述na2so3的工作浓度为0.250g/l，所述芬母多肽的工作浓度为1mg/l。
[0077]
实验例
[0078]
1、检测不同稀释液对质控品的影响。
[0079]
(1)预实验：生理盐水稀释质控品的稀释度确定。
[0080]
用生理盐水稀释新拆封的液体质控品，稀释度包括1:1、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320，每个稀释度取300μl为样本，做3个复孔，与普通待检样本一起进行核酸提取和扩增。
[0081]
(2)检测冻融次数对质控品原液的影响。
[0082]
取新拆封的液体质控品原液，分装于12个无dna/rna酶离心管，每管320μl，分为4组，每3管为一组，分别于-20℃冻存/融解操作0、1、2、3次。每次冻融操作为先放置于-20℃冻存1小时后，取出平衡半小时恢复至室温，再放回-20℃进行下一次冻存。每管取300μl为样本，与普通待检样本一起进行核酸提取和扩增。
[0083]
(3)不同稀释液在不同稀释度下的基线检测。
[0084]
分别用生理盐水(normal saline,ns)、实施例1的自配稀释液(self-formulated,sf)和邦德盛厂家稀释液(bds)三种稀释新拆封的液体质控品，做好标记(n(或ns)代表生理盐水，h(或sf)代表自配稀释液，b(或bds)代表邦德盛厂家稀释液)，质控品用每种稀释液做3个稀释浓度(1:20，1:80，1:320)，按每管320μl进行分装。用三组稀释液稀释的质控品中各取3管，分别吸取300μl为样本，与普通待检样本一起提取和扩增核酸，作为基线数据。稀释质控品原液及分装质控品稀释液的这一天记为day0。
[0085]
(4)检测不同存放温度与存放时间的影响。
[0086]
上述用三组稀释液稀释的质控品中剩余管分为三组，分别存放于4℃(2-8℃)、-20
℃和室温(20-25℃)，做好温度标记。在day0的第二天开始记为day1，不间断开始以下存放时间点实验。
[0087]
分别于day1、day3、day7(week1)、day14(week2)、day21(week3)取出存放于-20℃、4℃(2-8℃)和室温(20-25℃)的三组稀释液各3管，即每次27管，平衡至室温后吸取300μl为样本，与普通待检样本一起提取和扩增核酸。每次记录核酸提取与扩增实验的相关信息。
[0088]
(5)核酸提取。
[0089]
参照试剂说明书的实验操作步骤，验证按照本实验室制定的标准操作规程操作，每管加入样品(液体质控品稀释液或原液)300μl进行磁珠法核酸提取，提取完成后加入60μl洗脱液，获得的核酸立即进行检测。
[0090]
(6)核酸扩增。
[0091]
按试剂盒说明书配制50μl反应体系，含2019-ncov-pcr反应液26μl/人份，2019-ncov-pcr-酶混合液4μl/人份，核酸样本20μl。每次实验均加入2个阴性对照、1个阳性对照和1个空白对照。实时荧光pcr扩增程序为：50℃30min；95℃1min；95℃15s，60℃30s，45个循环；25℃10s。上机检测新冠病毒orf1ab和n靶基因，以及内控(ic)基因片段rnase p。
[0092]
(7)核酸检测。
[0093]
1)试剂配制。
[0094]
①
取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用。
[0095]
②
湖南圣湘核酸提取或纯化试剂盒所含组分如下表所示。
[0096]
表1试剂盒所含组分
[0097]
序号试剂名称规格(96t)1s10015-提取溶液1(96a)500μl/孔*96孔*1板2s10015-洗涤液1(96a)750μl/孔*96孔*1板3s10015-洗涤液2(96a)750μl/孔*96孔*1板4s10015-洗涤液3(96a)60μl/孔*96孔*1板5s10015-磁珠溶液(96a)3.5ml/管*1管6蛋白酶k20μl/孔*96孔*1板
[0098]
③
湖南圣湘新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒所含组分如下表所示。
[0099]
表2试剂盒所含组分
[0100]
序号试剂名称规格(48t)12019-ncov-pcr-反应液1248μl/管*1管22019-ncov-pcr-酶混合液96μl/管*1管32019-ncov-pcr-阳性对照500μl/管*1管42019-ncov-pcr-阴性对照500μl/管*1管
[0101]
④
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(2019-ncov-pcr反应液26μl/人份+2019-ncov-pcr-酶混合液4μl/人份)取相应量的反应液、酶混合液，充分混匀成pcr-mix，瞬时离心后备用。
[0102]
2)样本前处理。
[0103]
①
标本前处理及核酸提取操作的工作人员应进行三级防护，并在生物安全柜中进行。在实验开始前用75％乙醇对生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪进行消毒，并紫
外线照射30min。在生物安全柜操作台面铺一层吸水纸。
[0104]
②
配制1％的消毒液和1mol/l的稀盐酸，在生物安全柜中的废液桶中放入1l含氯1％的消毒液，用于丢弃标本及实验中产生的废液以及与标本接触产生的实验耗材，准备另一只桶装1mol/l的稀盐酸，用于装接触过核酸的耗材。
[0105]
3)核酸提取。
[0106]
①
准备工作。
[0107]
a按照“s10015-洗涤液2”标签指示，使用前加入相应量的无水乙醇。
[0108]
b根据样品数量，将蛋白酶k(20μl/人份)和s10015-磁珠溶液(30μl/人份)按照比例混合成蛋白酶k-磁珠混合液，震荡混匀，低速瞬时离心(推荐使用800rpm离心10s)。
[0109]
②
操作过程。
[0110]
a根据待测样本数量取1.5ml离心管若干，每管加入300μl样品。
[0111]
b加入500μl s10015-提取溶液1和50μl蛋白酶k-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。
[0112]
c室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)。
[0113]
d加入750μl s10015-洗涤液1，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃(注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)。
[0114]
e加入750μl s10015-洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃，继续于磁性分离器上静置2min，将液体完全吸尽。(注意不要吸到管壁内侧的磁珠；若此时洗涤液并非无色透明，需重复该步骤)。
[0115]
f室温开盖静置5min(注意：乙醇残留会对后续实验造成不良影响，需保证乙醇充分挥发；同时不要干燥太长时间，以免磁珠挂壁难以洗脱)。
[0116]
g加入30～100μl(推荐60μl洗脱)s10015-洗脱液s，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置5min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5ml离心管中。
[0117]
③
核酸提取仪按设定的程序操作，具体操作详见酸提取仪仪器操作说明。
[0118]
a根据样品数量，将蛋白酶k(20μl/人份)和s10015-磁珠溶液(30μl/人份)按照比例混合成蛋白酶k-磁珠混合液，震荡混匀，低速瞬时离心(推荐使用800rpm离心10s)。
[0119]
b取出试剂盒的所需组份，去除封口袋和封口膜，插到48/96通道的仪器。
[0120]
c取出样品板，每孔加入300μl待检样品和50μl蛋白酶k-磁珠混合液。
[0121]
d打开机器，启动对应程序。
[0122]
e把48/96孔板放置到仪器与程序对应的孔位中。
[0123]
f约15～30分钟后，提取程序结束。
[0124]
g取出含核酸溶液的48/96孔板，转移核酸并保存于-25～8℃。
[0125]
4)pcr扩增。
[0126]
①
将pcr反应管放入扩增仪样本槽，按对应顺序设置阳性、阴性对照及待测样本，并设置样本名称。
[0127]
②
荧光检测通道选择。
[0128]
a选择fam(orf-1ab)和rox(n基因)(reporter:fam/rox，quencher:none)通道检测
2019-ncov病毒核酸。
[0129]
b选择hex或vic通道(reporter:hex/vic，quencher:none)检测内标。
[0130]
c设置sample volume为50。
[0131]
③
仪器参数程序设计如下表所示。
[0132]
表3仪器参数程序设计
[0133][0134]
④
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
[0135]
5)实验室消毒。
[0136]
用75％乙醇对核酸提取仪进行处理并紫外线照射30分钟，在实验室空气中喷洒75％乙醇，10min后开启通风装置通风10min，再开启实验室紫外灯照射30min，紫外线照射后，工作人员用1mol/l的稀盐酸处理工作台面和地面，并开启实验室通风装置通风，用清水清洁台面和地面。
[0137]
6)结果分析。
[0138]
反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold值(可根据实际情况自行调整，start值可以在3～15、end值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到plate窗口下记录定性结果。
[0139]
(8)质量控制与结果判读。
[0140]
1)室内质控。
[0141]
①
质控品来源：第三方质控品。
[0142]
②
每批检测设立两个阴性质控，一份弱阳性质控，一份空白质控，并随机放在临床待检样本中间。
[0143]
③
弱阳性质控测定为阳性，阴性质控测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因并采取纠正措施，必要时对样本进行复查。
[0144]
④
阴性对照：fam、rox及内标通道均无ct值或ct＞40。
[0145]
⑤
弱阳性对照：fam、rox及内标通道均与质控品说明书相符。
[0146]
⑥
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
[0147]
2)结果判读。
[0148]
①
先分析内标在hex/vic通道是否有扩增曲线，且ct≤40，若有，表示本次检测有效，可继续进行后续分析：
[0149]
a若fam或rox通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40，标注该样本实验号，使用
博杰试剂复查(硕世试剂提取)，若结果一致为阳性，则可判读阳性，若博杰试剂结果为阴性则判读阴性，若博杰试剂结果同样为某一个通道信号阳性，则判读为疑似，建议重新采样检测；
[0150]
b若fam及rox通道均未检测到典型的s型扩增曲线(no ct)，或ct＞40，表示2019-ncov病毒为阴性。
[0151]
c若fam和rox通道同时检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40，标注该样本实验号，使用圣湘或博杰试剂双复查，若结果一致，可判读为阳性，若结果不一致则需再次复查。
[0152]
②
若内标在vic通道没有检测到ct或ct＞40，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新提取核酸进行检测。若ct值在38至40之间，同样采用圣湘试剂复查。若圣湘试剂复查结果vic通道任然没有检测到ct或ct＞40，则提取失败建议重新采样。
[0153]
③
灰度区结果判定：如果某样本在fam或rox通道荧光信号有明显增幅，但ct值大于40，则该样本处于灰度区，需要复检。如复检结果仍处于灰度区，则判断为阳性。
[0154]
(9)结果分析。
[0155]
反应结束后，根据分析后图像调节baseline的start、end值及threshold值。根据核酸扩增试剂盒说明书中的结果判读标准，空白、阴性对照结果各通道均无ct值或ct＞40，且阳性对照结果各通道ct≤35时认为结果有意义。可接受的阳性样本结果应为ct≤40，且各通道均检测到典型的s型扩增曲线。
[0156]
(10)统计学分析。
[0157]
采用spss23.0统计软件进行数据处理及统计学分析，正态分布的连续变量以均数
±
标准差表示。两组间均值比较采用独立样本t检验，多组件均值比较采用单因素方差分析。p《0.05为差异有统计学意义。
[0158]
2、结果分析。
[0159]
(1)预实验：生理盐水稀释质控品的稀释度确定。
[0160]
结果如图1、图2、3和下表所示，稀释度越高，ct值越大，稀释度从1:1到1:320检测结果均在可接受范围内(ct《36，且各通道均检测到典型的s型扩增曲线)。除1:160和1:320稀释度的orf1ab基因ct值结果略超出(分别为35.15
±
1.15和35.88
±
0.24)外，其他各通道结果均低于35。
[0161]
表4生理盐水稀释质控品的稀释度确定结果
[0162][0163]
结果显示：液体质控品可以进行稀释使用，本实验中进行最高1:320的稀释，结果
可控制在ct值35左右，符合检测阳性结果判定标准。但应注意到不同批号的质控品间的浓度差异，需要进行浓度估算，确保稀释后浓度符合试剂盒说明书的性能指标中关于最低检测限的要求。本实施例中，预实验及冻融实验使用的批号为2020010，所使用批次质控品的均值浓度为2.88e+04copies/ml，为6.23e+03～6.04e+04copies/ml，进行1：320稀释后浓度为90copies/ml(19.47～188.75copies/ml)；稀释液及存放条件实验使用的批号为2020012，所使用批次质控品的均值浓度为1.95e+04copies/ml，为6.30e+03～6.01e+04copies/ml，进行1：320稀释后浓度为61copies/ml(19.69～187.81copies/ml))，使用的核酸扩增试剂盒的最低检测限为200copies/ml。
[0164]
(2)检测冻融次数对质控品原液的影响。
[0165]
根据实际应用、运输中可能出现的反复冻融情况，将未拆封的质控品原液进行分装，分别置于-20℃冻存1小时，取出平衡半小时恢复至室温后再次进行冻存，反复冻存/融解操作0-3次后，将所有样本进行核酸提取和扩增检测。结果发现，冻融1-3次的样本与未冻融样本结果差异无统计学意义(p《0.05)，表明该液体质控品原液稳定性较好。
[0166]
结果如图4、图5、图6和下表所示，质控品原液在3次内的冻融对结果无影响，但考虑到运输过程中可能存在的温度降低意外，在使用过程中尽量保存1-2次融解内使用完毕或分装使用。
[0167]
表5冻融次数对质控品原液影响的检测结果
[0168][0169]
(3)不同稀释液在不同稀释度下的基线检测。
[0170]
选择1:20，1:80，1:320三个稀释度制备的质控品评价其稳定性，同时以不同稀释液在不同稀释度下的未冻存质控品检测结果为后续冻存条件稳定性实验的基线检测结果(day0)。
[0171]
结果如图7、图8、图9、图10和下表所示，在0天时除1:320稀释度下，生理盐水组相对于邦德盛组有差异(p《0.05)外，同一稀释度下三种不同稀释液均无组间差异。
[0172]
表6不同靶基因以不同稀释液在不同稀释度下的基线检测结果
[0173][0174]
*表示p《0.05。1:320稀释度下，生理盐水组相对于邦德盛组差异有统计学意义。
[0175]
结果显示：现配现用时，三种稀释液稀释均可。除生理盐水1:320稀释外，三种稀释液用三种稀释度检测的ct值无差异。
[0176]
(4)不同存放温度与存放时间的影响。
[0177]
质控品采用不同稀释液1:320稀释后存放于不同温度下1天后3种基因(ic、orf-lab、n基因)结果比较如图11所示；
[0178]
质控品采用不同稀释液1:80稀释后存放于不同温度下21天后3种基因(ic、orf-lab、n基因)结果比较如图12所示；
[0179]
质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放不同时间的orf-lab基因结果影响如图13所示；
[0180]
质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下分别存放1天、3天、7天、14天和21天的荧光定量pcr检测orf1-ab基因结果分别如图14、15、16、17、18所示；
[0181]
质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放不同时间的n基因结果影响如图19所示；
[0182]
质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下分别存放1天、3天、7天、14天和21天的荧光定量pcr检测n基因结果分别如图20、21、22、23、24所示；
[0183]
质控品采用不同稀释液且稀释不同倍数在不同温度下存放不同时间的ic基因结果影响如图25所示；
[0184]
质控品采用生理盐水不同稀释倍数对3种基因结果影响如图26所示，图中每组基因从左到右依次为orf-ab基因、n基因、ic基因；
[0185]
新型冠状病毒质控品原液反复冻融3次对3种基因结果影响如图27所示，图中每组基因从左到右依次为orf-ab基因、n基因、ic基因。
[0186]
结果显示：1)稀释后不同存放条件对三种靶基因结果检出影响的总体评价。
[0187]
①
ic内控基因在各种稀释液和存放条件下的检测结果均表现稳定，除生理盐水1:80稀释后存放于常温下未检出结果，其他各种稀释液和存放条件均有明显阳性结果检出。
[0188]
②
orf-1ab基因检测结果稳定性最差，在1:320稀释度下，生理盐水和邦德盛稀释液均无法保证存放一天后阳性结果的有效检出
[0189]
③
n基因在各种稀释液和存放条件下的检测结果较orf-1ab基因稳定，除生理盐水1:320稀释度存放于4℃下未检出结果，其他条件可以在一周内保持稳定阳性检出
[0190]
结果显示：除生理盐水1:80稀释后存放于常温外，作为内控(ic)基因，rnase p片段在不同稀释液、稀释度和存放条件下的检出情况均较为稳定。n基因检测的ct值较orf-1ab基因低，且不同方式稀释和存放条件下检测阳性结果检出更为稳定，即2个靶基因的检出率存在差别，这与之前的研究报道一致，但稳定性结论相反，无论是原液还是稀释液，均发现n基因的ct值明显低于orf-1ab基因的ct值。这可能与2种靶基因间的固有保守性和试剂盒中探针/引物序列设计的灵敏度有关。
[0191]
2)稀释液间的比较。
[0192]
根据本次实验结果，自配稀释液在不同存放条件下的检测结果ct值均低于其他两种稀释液，且同一稀释浓度的稀释液置于4℃和-20℃存放不同天数时的ct值差距不明显，表明其稳定性和对靶基因降解的保护作用优于其他两种稀释液。除1:320稀释度外，自配稀释液配制的阳性质控品中两种靶基因的ct值均位于35以下或略微超出；而邦德盛稀释液和生理盐水配制的质控品中两种靶基因的ct值在存放第3天时已明显超出35，需要注意弱阳性的可能。
[0193]
此外，本研究发现，自配稀释液(sf)在不同条件下稳定性最好。3个稀释浓度(1:
20，1:80，1:320)在4℃(2-8℃)、-20℃和室温(20-25℃)三种不同存放温度下，自配稀释液对阳性质控品中两种靶基因的保护作用均可以达到21天。
[0194]
生理盐水(ns)稀释的液体质控品在不同条件下稳定性最差，当稀释度较大或存放温度较高时无法有效保护靶基因结果检出。稀释度(1:320)对生理盐水稀释液orf-1ab基因检测结果的影响较大，放置1天就无法测出结果；室温和4℃两种存放温度对生理盐水稀释液的影响较大，1:80和1:320稀释浓度下在存放第3天就开始影响orf-1ab和n两种靶基因的结果检出。
[0195]
邦德盛稀释液(bds)对液体质控品的保护作用优于生理盐水，但同样受稀释浓度和存放温度的影响较大。1:320稀释度对邦德盛稀释液orf-1ab基因检测结果的影响较大，三种温度存放一天就无法测出结果；室温和4℃两种存放温度液对邦德盛稀释液的orf-1ab基因检测结果的影响较大，尤其是在第7-14天间，而当存放到第21天时，室温存放的n基因检测结果也开始受到影响。若存放于-20℃，邦德盛稀释液对阳性质控品中两种靶基因的保护作用可以达到21天，但需要注意的是结果转变为弱阳性的可能，ct值接近40。
[0196]
结果显示：生理盐水在不同条件下的稳定性最差，邦德盛稀释液优于生理盐水，不同条件下稳定性最好的是自配稀释液。这可能与邦德盛稀释液和自配稀释液中添加的不同成分有关，这些成分有助于保护待检样本中的核酸序列不被降解，而自配稀释液中额外添加的成分有助于提高不同存放温度下的稳定性，有助于提高液体质控品存放温度、存放时间的适用范围，避免实际操作中可能存在的影响因素干扰阳性检出率。
[0197]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0198]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。