静脉畸形及相关综合征的无创检测方法及装置

1.本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种静脉畸形及相关综合征的无创检测方法及装置。


背景技术：

2.静脉畸形是静脉内皮细胞先天畸形发育造成的常见疾病，常在出生时出现，好发于头面部，也可累及四肢、躯干。静管畸形影响外观，给患者带来巨大的生活负担，严重者甚至引起器官移位、骨骼畸形、功能障碍。静脉畸形是先天性的血管畸形，随着个体的成长而发展，并且不会自发消退。静脉畸形被认为是由胚胎发生过程中异常信号转导导致的，在过去的二十年中，多种致病性基因突变被鉴定，并开始阐明脉管畸形的病理生理途径。静脉畸形是由tek或pik3ca的激活突变引起的。淋巴管畸形常伴随pik3ca基因突变，pi3k/akt/mtor是其主要的下游传导信号。klippel-trenaunay综合征(kts)的特征是不对称的下肢和伴有或不伴有静脉畸形或淋巴管畸形的毛细血管畸形，是由pi3k-akt-mtor通路异常激活引起的。西罗莫司作为pi3k/akt/mtor通路抑制剂已被证实在严重静脉畸形患者中是有效和安全的。静脉畸形相关分子诊断及分型，以及后续的靶向治疗成为未来治疗静脉畸形的希望及研究热点。
3.然而，传统的基于组织活检的分子检测在静脉畸形遗传学研究中面临很大的困境。组织活检可能存在严重的风险，导致出血，溃烂，病灶复发，皮肤瘢痕等问题，难以保证安全性，且组织标本无法反复取材。其次，基于组织活检的分子检测存在组织异质性，降低了检测的灵敏度及准确性。近年来，循环肿瘤dna作为液体活检主要手段,可实现非入侵的反复获取,及克服肿瘤异质性并能够实时监测肿瘤的变化情况。但是静脉畸形作为一种良性疾病，病灶细胞缺乏增殖凋亡脱落能力，外周循环中的游离dna含量非常少,常见的检测手段不能准确的检测,需要灵敏度更高的检测方法。
4.栓塞硬化治疗是目前临床上最为广泛应用治疗静脉畸形的手段。主要应用的硬化剂包括乙醇，博莱霉素(平阳霉素)、泡沫硬化剂(聚多卡醇、聚桂醇、十四烷基硫酸钠)等。其原理在于损伤血管内皮细胞及血管壁结构，导致内皮细胞坏死，引起继发凝血及血栓形成，从而导致血管萎缩纤维化。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种静脉畸形及相关综合征的无创检测方法及装置。
6.本发明第一方面提供一种静脉畸形及相关综合征的无创检测方法，至少包括如下步骤：
7.(1)提供检测对象血浆游离dna中的静脉畸形相关基因的测序数据；所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个；
8.(2)将所述测序数据与参考序列进行比对，获得与静脉畸形及相关综合征相关的
突变。
9.本发明第二方面提供一种静脉畸形及相关综合征的无创检测装置，至少包括如下模块：
10.测序模块，用于提供检测对象血浆游离dna中的静脉畸形相关基因的测序数据；所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个；
11.比对模块，用于将所述测序数据与参考序列进行比对，获得与静脉畸形及相关综合征相关的突变数据。
12.本发明第三方面提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现前述的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法。
13.本发明第四方面提供一种计算机处理设备，包括处理器及前述的计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序，实现前述的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法的步骤。
14.本发明第五方面提供一种电子终端，包括：处理器、存储器、及通信器；所述存储器用于存储计算机程序，所述通信器用于与外部设备进行通信连接，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述终端执行前述的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法。
15.本发明第六方面提供静脉畸形相关基因用于制备静脉畸形及相关综合征的无创检测产品的用途，所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个。
16.本发明第七方面一种静脉畸形及相关综合征的无创检测试剂盒，所述试剂盒中包括静脉畸形相关基因的特异性检测物质；所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个。
17.如上所述，本发明的一种静脉畸形及相关综合征的无创检测方法及装置，具有以下有益效果：
18.第一，使用游离dna液态活检替代组织活检，避免了组织活检带来的一系列并发症，做到非侵入，操作安全，取材方便，副作用小，可重复取材。第二，使用硬化剂栓塞静脉畸形引起病灶静脉内皮细胞迅速剥离，进入循环血液，提高外周循环中游离dna含量，增加检测灵敏度。第三，结合游离dna及高通量测序，避免了测序深度较低，难以有效检测血液中痕量的游离dna变异。第四，本方法可广泛应用于静脉畸形及相关综合征人群的突变检测中，构建完善的静脉畸形生物样本库，为“临床+生物”研究提供原始数据支持。
附图说明
19.图1：16例静脉畸形(包括混合静脉畸形)及kt综合征突变基因分布。
20.图2：组织样本，硬化栓塞前游离dna，以及硬化栓塞(乙醇)后游离dna三种不同检出方法监测基因突变的检出概率对比。纵坐标为检出率。
具体实施方式
21.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
22.此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个步骤之间的组合连接关系并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他步骤或在这些明确提到的两个步骤之间还可以插入其他步骤，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
23.请参阅图1至图2。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，虽图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
24.本发明已实施例的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法，至少包括如下步骤：
25.(1)提供检测对象血浆游离dna中的静脉畸形相关基因的测序数据；所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个；
26.(2)将所述测序数据与参考序列进行比对，获得与静脉畸形及相关综合征相关的突变。
27.在一种实施方式中，所述测序数据为以所述检测对象血浆游离dna为模板，利用静脉畸形相关基因的特异性检测物质建立静脉畸形相关基因的捕获文库，对所述静脉畸形相关基因的捕获文库进行高通量测序获得。
28.进一步的，所述静脉畸形相关基因中的任一个或多个基因发生突变，即可认为检测具有发生静脉畸形。
29.可选的，所述静脉畸形相关基因的特异性检测物质为静脉畸形相关基因的特异性检测探针。
30.可选的，tek基因的特异性检测探针选自seq id no:1-71的任一个或多个；
31.可选的，pik3ca基因的特异性检测探针选自seq id no:72-146的任一个或多个；
32.可选的，akt1基因的特异性检测探针选自seq id no:147-185的任一个或多个；
33.可选的，mtor基因的特异性检测探针选自seq id no:186-364的任一个或多个；
34.可选的，pten基因的特异性检测探针选自seq id no:365-394的任一个或多个。
35.所述参考序列为静脉畸形相关基因的序列。
36.所述参考序列为动静脉畸形相关基因的序列，例如可以为人类参考基因组hg19中的相关序列。
37.表1
38.39.40.41.42.43.44.45.46.47.48.49.50.51.52.53.54.[0055][0056]
进一步的，测序时的深度阈值为5000x，突变频率阈值：0.05％。
[0057]
所述参考序列即为静脉畸形相关基因的序列。
[0058]
相关综合征包括klippel-trenaunay综合征，maffucci综合征和blue rubber bleb nevus综合征。
[0059]
优选的，所述血浆来源于检测对象的外周循环血，外周循环血的采集时间为使用硬化剂后5分钟-72小时。
[0060]
所述硬化剂可以为乙醇及其制剂，泡沫硬化剂，博莱霉素或平阳霉素。
[0061]
所述泡沫硬化剂选自聚桂醇，聚多卡醇或十四烷基硫酸钠。
[0062]
所述静脉畸形及相关综合征的无创检测方法用于非诊断和治疗目的。例如可以用于基础研究等。
[0063]
本发明一实施例的静脉畸形及相关综合征的无创检测装置，至少包括如下模块：
[0064]
测序模块，用于提供检测对象血浆游离dna中的静脉畸形相关基因的测序数据；所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个；
[0065]
比对模块，用于将所述测序数据与参考序列进行比对，获得与静脉畸形及相关综合征相关的突变数据。
[0066]
在一种实施方式中，所述测序数据为以所述检测对象血浆游离dna为模板，利用静脉畸形相关基因的特异性检测物质建立静脉畸形相关基因的捕获文库，对所述静脉畸形相关基因的捕获文库进行高通量测序获得。
[0067]
可选的，所述静脉畸形相关基因的特异性检测物质为静脉畸形相关基因的特异性检测探针。
[0068]
可选的，tek基因的特异性检测探针选自seq id no:1-71的任一个或多个；
[0069]
可选的，pik3ca基因的特异性检测探针选自seq id no:72-146的任一个或多个；
[0070]
可选的，akt1基因的特异性检测探针选自seq id no:147-185的任一个或多个；
[0071]
可选的，mtor基因的特异性检测探针选自seq id no:186-364的任一个或多个；
[0072]
可选的，pten基因的特异性检测探针选自seq id no:365-394的任一个或多个。
[0073]
相关综合征包括klippel-trenaunay综合征，maffucci综合征和blue rubber bleb nevus综合征。
[0074]
所述参考序列为静脉畸形相关基因的序列。
[0075]
测序时的深度阈值为5000x，突变频率阈值：0.05％。
[0076]
所述血浆来源于检测对象的外周循环血，外周循环血的采集时间为使用硬化剂后5分钟-72小时。
[0077]
本发明一实施例的计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现前述的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法。
[0078]
本发明一实施例的一种计算机处理设备，包括处理器及前述的计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序，实现前述的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法的步骤。
[0079]
本发明一实施例的电子终端，包括：处理器、存储器、及通信器；所述存储器用于存储计算机程序，所述通信器用于与外部设备进行通信连接，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述终端执行前述的静脉畸形及相关综合征的无创检测方法。
[0080]
由于本实施例中的装置与前述方法实施例的原理基本相同，在上述方法和装置实施例中，对相同特征的定义、计算方法、实施方式的列举及优选实施方式的列举阐述可以互用，不再重复赘述。
[0081]
需要说明的是，应理解以上装置的各个模块的划分仅仅是一种逻辑功能的划分，实际实现时可以全部或部分集成到一个物理实体上，也可以物理上分开。这些模块可以全部以软件通过处理元件调用的形式实现；也可以全部以硬件的形式实现；还可以部分模块通过处理元件调用软件的形式实现，部分模块通过硬件的形式实现。例如，获取模块可以为
单独设立的处理元件，也可以集成在某一个芯片中实现，此外，也可以以程序代码的形式存储于存储器中，由某一个处理元件调用并执行以上获取模块的功能。其它模块的实现与之类似。此外这些模块全部或部分可以集成在一起，也可以独立实现。这里所述的处理元件可以是一种集成电路，具有信号的处理能力。在实现过程中，上述方法的各步骤或以上各个模块可以通过处理器元件中的硬件的集成逻辑电路或者软件形式的指令完成。
[0082]
例如，以上这些模块可以是被配置成实施以上方法的一个或多个集成电路，例如：一个或多个特定集成电路(application specific integrated circuit，简称asic)，或，一个或多个微处理器(digital singnal processor，简称dsp)，或，一个或者多个现场可编程门阵列(field programmable gate array，简称fpga，或图形处理器(graphics processing unit，简称：gpu))等。再如，当以上某个模块通过处理元件调度程序代码的形式实现时，该处理元件可以是通用处理器，例如中央处理器(central processing unit，简称cpu)或其它可以调用程序代码的处理器。再如，这些模块可以集成在一起，以片上系统(system-on-a-chip，简称soc)的形式实现。
[0083]
本发明提供的一种电子终端包括处理器、存储器、通信器、通信接口和系统总线；存储器和通信接口通过系统总线与处理器和通信器连接并完成相互间的通信，存储器用于存储计算机程序，通信器、通信接口用于和其他设备进行通信，处理器和通信器用于运行计算机程序，使电子终端执行如上方法的各个步骤。
[0084]
上述提到的系统总线可以是外设部件互连标准(peripheral component interconnect，简称pci)总线或扩展工业标准结构(extended industry standard architecture，简称eisa)总线等。该系统总线可以分为地址总线、数据总线、控制总线等。为便于表示，图中仅用一条粗线表示，但并不表示仅有一根总线或一种类型的总线。通信接口用于实现数据库访问装置与其他设备(例如客户端、读写库和只读库)之间的通信。存储器可能包含随机存取存储器(random access memory，简称ram)，也可能还包括非易失性存储器(non-volatile memory)，例如至少一个磁盘存储器。
[0085]
上述的处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(central processing unit，简称cpu)、网络处理器(network processor，简称np)等；还可以是数字信号处理器(digital signal processing，简称dsp)、专用集成电路(application specific integrated circuit，简称asic)、现场可编程门阵列(field－programmable gate array，简称fpga)或图形处理器(graphics processing unit，简称：gpu)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。
[0086]
本领域普通技术人员可以理解：实现上述各方法实施例的全部或部分步骤可以通过计算机程序相关的硬件来完成。前述的计算机程序可以存储于一计算机可读存储介质中。该程序在执行时，执行包括上述各方法实施例的步骤；所述计算机可读存储介质可包括，但不限于，软盘、光盘、cd-rom(只读光盘存储器)、磁光盘、rom(只读存储器)、ram(随机存取存储器)、eprom(可擦除可编程只读存储器)、eeprom(电可擦除可编程只读存储器)、磁卡或光卡、闪存、或适于存储机器可执行指令的其他类型的介质/机器可读介质。所述计算机可读存储介质可以是未接入计算机设备的产品，也可以是已接入计算机设备使用的部件。
[0087]
在具体实现上，所述计算机程序为执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例
程、程序、对象、组件、数据结构等等。
[0088]
本发明提供的静脉畸形相关基因用于制备静脉畸形及相关综合征的无创检测产品的用途，所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个。
[0089]
优选的，所述产品中还包括硬化剂。
[0090]
所述硬化剂可以为乙醇及其制剂，泡沫硬化剂，博莱霉素或平阳霉素。
[0091]
所述泡沫硬化剂选自聚桂醇，聚多卡醇或十四烷基硫酸钠。
[0092]
在一种实施方式中，所述静脉畸形相关基因的特异性检测物质为静脉畸形相关基因的特异性检测探针。
[0093]
在一种实施方式中，tek基因的特异性检测探针选自seq id no:1-71的任一个或多个；
[0094]
在一种实施方式中，pik3ca基因的特异性检测探针选自seq id no:72-146的任一个或多个；
[0095]
在一种实施方式中，akt1基因的特异性检测探针选自seq id no:147-185的任一个或多个；
[0096]
在一种实施方式中，mtor基因的特异性检测探针选自seq id no:186-364的任一个或多个；
[0097]
在一种实施方式中，pten基因的特异性检测探针选自seq id no:365-394的任一个或多个。
[0098]
本发明一实施例的静脉畸形及相关综合征的无创检测试剂盒，所述试剂盒中包括静脉畸形相关基因的特异性检测物质；所述静脉畸形相关基因选自tek、pik3ca、akt1、mtor和pten中的一个或多个。
[0099]
优选的，所述试剂盒中还包括硬化剂。
[0100]
所述静脉畸形相关基因的特异性检测物质为静脉畸形相关基因的特异性检测探针。
[0101]
所述硬化剂可以为乙醇及其制剂，泡沫硬化剂，博莱霉素或平阳霉素。
[0102]
所述泡沫硬化剂选自聚桂醇，聚多卡醇或十四烷基硫酸钠。
[0103]
在一种实施方式中，所述静脉畸形相关基因的特异性检测物质为静脉畸形相关基因的特异性检测探针。
[0104]
在一种实施方式中，tek基因的特异性检测探针选自seq id no:1-71的任一个或多个；
[0105]
在一种实施方式中，pik3ca基因的特异性检测探针选自seq id no:72-146的任一个或多个；
[0106]
在一种实施方式中，akt1基因的特异性检测探针选自seq id no:147-185的任一个或多个；
[0107]
在一种实施方式中，mtor基因的特异性检测探针选自seq id no:186-364的任一个或多个；
[0108]
在一种实施方式中，pten基因的特异性检测探针选自seq id no:365-394的任一个或多个。
[0109]
本发明试剂盒中还可以包括其他一些pcr所需要的常规试剂。由于此类pcr常用试
剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
[0110]
前述静脉畸形及相关综合征的无创检测试剂盒可用于静脉畸形及相关综合征检测。
[0111]
实施例1
[0112]
游离dna血建库捕获流程：
[0113]
一、游离dna抗凝血样本处理
[0114]
①
样本记录：
[0115]
收样日期样本类型采血管数量总体积20180528游离dna抗凝血vangenes cell-free dna preservative2管20ml
[0116]
②
血浆处理方法(两步法分离血浆)：
[0117]
在游离dna提取区进行实验。
[0118]
1.设置超低温离心机13300r/min，4℃，空转10min降温。
[0119]
2.将采血管中的血样分装到1.5ml的ep管中，用超低温离心机，4℃，1600g，离心10min。
[0120]
3.取上清于1.5mlep管中，不要将下层的血细胞以及白膜层吸进来。
[0121]
4.再用超低温离心机，4℃，16000g，离心10min。
[0122]
5.取上清于1.5mlep管中，不要将白色沉淀吸进来。-20℃保存(长期保存于-80℃，血浆只能冻融一次)
[0123]
③
质控点一：若血浆颜色异常，如偏红色或浑浊，有絮状沉淀，则样品不合格，需重新送样。
[0124]
④
分离血浆结果：
[0125]
分离日期分离血浆管血浆总体积编号2018052810管12ml35
[0126]
二、dna抽提：
[0127]
①
基本信息：
[0128]
实验日期样本类型数量总体积编号20180528血浆5管6ml35
[0129]
②
在游离dna提取区进行实验。
[0130]
将金属浴设置为60℃；打开制冰机，开始制冰。
[0131]
1.按下表配制试剂，配6支。
[0132]
样本数buffer acl量carrier rna(ave中)取1900μl5.6μl
[0133]
2.取6个5ml离心管，在管盖均标记上姓名，每个5ml离心管中加100μl蛋白酶k。
[0134]
3.加1ml血浆至5ml离心管中。
[0135]
4.加800μl buffer acl(含有1.0μg carrier rna)关盖子mix30s。(确保mix过程中形成漩涡)此步不可停，立刻做5。
[0136]
5. 60℃放30min。
[0137]
6.放回架子上，打开盖子。
[0138]
7.加1800μl buffer acb，盖盖子充分混匀15-30s。
[0139]
8.在冰上放裂解液-buffer acb混合物5min。
[0140]
9.取1个qiaamp mini column，盖子上标记上姓名，加650μl上步混合物到qiaamp mini column，13300r/min，1min，如此循坏，将混合物全部离心。
[0141]
10.加600μl buffer acw1，13300r/min，1min。
[0142]
11.加750μl buffer acw2，13300r/min，1min。
[0143]
12.加750μl etoh，13300r/min，1min。
[0144]
13.空转13300r/min，3min。
[0145]
14. 56℃烘干10min。
[0146]
15.加50μl buffer ave，放3min。
[0147]
16.准备一个新1.5mlep管，标记上姓名，日期20180528，dna。将柱子放在新1.5mlep管中，13300r/min，1min。
[0148]
17.进行qubit定量。浓度为1.34ng/μl。游离dna浓度一般在0.3～10之间。
[0149]
三：建库
[0150]
①
基本信息：
[0151]
实验日期样本类型数量总体积编号浓度投入量20180529cf-dna1管50μl351.34ng/μl50μl
[0152]
②
在建库区进行实验操作：
[0153]
1.末端修复
[0154]
1.1反应体系如下：
[0155]
input dna50μlend prep mix15μl总体积65μl
[0156]
1.2反应程序如下：
[0157]
103℃热盖
[0158]
20℃15min65℃15min4℃hold
[0159]
2.连接接头
[0160]
2.1反应体系如下：
[0161]
步骤1产物65μlrapid ligation buffer25μlrapid dna ligase5μldna adapter-s for illumina2.5μl水2.5μl总体积100μl
[0162]
2.2反应程序如下：
[0163]
103℃热盖
[0164]
20℃15min4℃hold
[0165]
2.3纯化：
[0166]
注：配制足量新鲜的80％乙醇，现用现配，每个样品每次纯化约需要400μl。
[0167]
a加60μl磁珠到上步产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀。室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上。
[0168]
b离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。
[0169]
c保持离心管在磁力架上，待溶液澄清(约5分钟)后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠。
[0170]
d保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的80％乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清。
[0171]
e重复步骤d，共漂洗两次。
[0172]
f用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇。开盖在空气中干燥3-5分钟。
[0173]
注意事项：确保磁珠只是刚刚晾干，磁珠此时看起来没有光泽。若磁珠没有完全晾干，酒精仍然残留在样品中，酒精会降低dna的洗脱速率，并可能干扰下游反应。
[0174]
g加入22.5μl灭菌水混匀后静置5分钟。
[0175]
h离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。
[0176]
i保持离心管在磁力架上，待溶液澄清(约5分钟)后，将20μl上清液转移至新的1.5ml的离心管中。
[0177]
3.扩增富集
[0178]
3.1反应体系如下：
[0179]
步骤2产物20μlvahts i5 pcr primer2.5μlvahts i7 pcr primer2.5μlamplification mix25μl总体积50μl
[0180]
3.2反应程序如下：
[0181]
103℃热盖
[0182][0183]
3.3纯化：
[0184]
注：配制足量新鲜的80％乙醇，现用现配，每个样品每次纯化约需要400μl。
[0185]
a加45μl磁珠到上步产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀。室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上。
[0186]
b离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。
[0187]
c保持离心管在磁力架上，待溶液澄清(约5分钟)后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠。
[0188]
d保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的80％乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清。
[0189]
e重复步骤d，共漂洗两次。
[0190]
f用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇。开盖在空气中干燥3-5分钟。
[0191]
注意事项：确保磁珠只是刚刚晾干，磁珠此时看起来没有光泽。若磁珠没有完全晾干，酒精仍然残留在样品中，酒精会降低dna的洗脱速率，并可能干扰下游反应；若磁珠晾的太干，磁珠会开裂，建议在步骤h延长孵育时间使其充分水化，否则会降低dna的洗脱效果，最终降低产量。
[0192]
g磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入22.5μl水覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠。
[0193]
h室温孵育2分钟。如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。
[0194]
i将离心管短暂离心后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清(约5分钟)。若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混匀未吸附的磁珠，使其重新悬浮，继续孵育直至没有磁珠残留在上清中。
[0195]
j小心吸取21μl上清转移至相应编号的新的小pcr管中。
[0196]
k进行qubit定量。浓度为69.2ng/μl。文库总量不能低于500ng。
[0197]
四：文库杂交封闭与浓缩:
[0198]
注：实验过程中用到的试剂在溶解后均需上下颠倒或轻轻震荡，瞬时离心，酶和探针仅需离心，无需震荡。全程放在冰上操作实验。
[0199]
4.1试剂准备
[0200]
un-blocker/mgi-blocker/mgi-dual-blocker：从-20℃冰箱取出，在室温(15～25℃)下融化。
[0201]
human cot-1 dna：从-20℃冰箱取出，在室温(15～25℃)下融化。
[0202]
4.2根据文库类型，将下述试剂混合于0.2mlpcr管(或8联排管)
[0203]
试剂量或体积单混或多混500ng(每个文库)human cot-1dna5μgun-blocker/mgi-blocker2μl
[0204]
注意：单混是human cot-1 dna加5μg为最佳。多混时human cot-1 dna可以每3个文库加5μg，多混超过3个文库时，human cot-1 dna的量要增加。
[0205]
4.3漩涡振荡，充分混匀上述封闭反应体系，瞬时离心，将所有组分收集到管底。
[0206]
4.4将0.2mlpcr管(或8联排管)置于真空旋转蒸发仪中，55～60℃真空旋转，将反应液蒸干。
[0207]
五.文库杂交捕获
[0208]
5.1从-20℃或4℃冰箱中取出以下试剂，在室温下融化：
[0209]
hyb_buffer
[0210]
enhancer
[0211]
panel probe
[0212]
注意：hyb_buffer需恢复至室温使用；若出现结晶，需要加热至65℃，充分溶解即可。
[0213]
5.2向步骤4.4中蒸干的0.2mlpcr管(或8联排管)中加入以下试剂：
[0214]
试剂体积hyb_buffer10μlenhancer2μlpanel probe(见表1)2μlnuclease-free water2μl
[0215]
注意：请采用优质0.2mlpcr管或8连排管避免蒸发。
[0216]
5.3用移液器吸打或涡旋振荡器振荡混匀，室温放置5-10min；再次吸打或者振荡混匀，瞬时离心。
[0217]
5.4在pcr仪上进行热循环孵化，热盖温度100-105℃。
[0218]
步骤温度时间step195℃2min
[0219]
5.5振荡混匀，瞬时离心。
[0220]
5.6立即放置于pcr仪中65℃的热循环2h或者过夜杂交，热盖温度75℃。
[0221]
步骤温度时间step165℃》30min,推荐2-4h
[0222]
六.准备洗脱液
[0223]
将各洗液提前放置至室温，按照下表稀释buffer到1
×
的体系(1个反应的量)
[0224]
试剂全称原液体积水体积总体积2
×
bwb140μl140μl280μl10
×
wⅰ30μl270μl300μl10
×
wⅱ16μl144μl160μl10
×
wⅲ16μl144μl160μl10
×
s-w32μl288μl320μl
[0225]
注意：如果10
×
wⅰ或10
×
s-w原液有颗粒，可65℃温育助溶。
[0226]
6.1以下试剂在杂交pcr仪65℃放置至少15min
[0227]
s-w：2次用量。取杂交反应2倍数量的pcr管(8联排管)，每管加入150μl，置于65℃杂交pcr仪上温浴。
[0228]
wⅰ:1次用量。取杂交反应同等数量的pcr管(8联排管)，每管加入125μl，置于65℃杂交pcr仪上温浴。
[0229]
6.2以下试剂在室温放置
[0230]
wⅰ：上述表配制的：160μl/反应,室温(15～25℃)放置。
[0231]
wⅱ：上述表配制的：160μl/反应,室温(15～25℃)放置。
[0232]
wⅲ：上述表配制的：160μl/反应,室温(15～25℃)放置。
[0233]
注意：wⅰ分别在65℃和室温各放置了一份，请注意区分。
[0234]
七.准备链霉亲和素磁珠
[0235]
probecap sa beads使用前10-20min准备即可，避免长时间室温放置。
[0236]
7.1从4℃冰箱取出probecap sa beads后，室温放置10min。
[0237]
7.2涡旋振荡15秒充分混匀。
[0238]
7.3按照每个反应取50μl磁珠，转入1.5ml离心管中。
[0239]
7.4将上步骤含probecap sa beads的1.5ml离心管放置在磁力架上，使磁珠与溶液彻底分离。
[0240]
7.5去除上清，保留磁珠。
[0241]
7.6准备洗脱如下：
[0242]
a.每管加入100μl的1
×
bwb，涡旋振荡10秒。
[0243]
b.将1.5ml离心管转移至磁力架上，使磁珠与溶液彻底分离。充分去除上清。
[0244]
7.7重复上述7.6步1次。在1.5ml离心管中加入50μl的1
×
bwb，充分混匀。
[0245]
7.8将磁珠混合液转移至0.2mlpcr管中。
[0246]
7.9将上步中的0.2mlpcr管放置在磁力架上，使磁珠与溶液彻底分离，去除上清保留磁珠，马上进行下步8，避免磁珠在空气中过度暴露。
[0247]
八.文库与链霉亲和素磁珠结合
[0248]
8.1将步骤7.9的含磁珠的0.2mlpcr管放于65℃pcr仪中。
[0249]
8.2将步骤5.6中在65℃杂交的杂交液16μl全部转移至上一步中对应的0.2mlpcr管中。
[0250]
8.3用移液器反复快速吸打10次或涡旋充分混匀。
[0251]
8.4在65℃杂交pcr仪(热盖75℃)中继续反应。
[0252]
步骤温度时间step165℃30～45min
[0253]
8.5每隔10～12min取出振荡5秒。立即放入pcr仪中进行反应，直至满足总反应时间。
[0254]
九.洗脱去除未结合的dna
[0255]
9.1准备65℃洗脱液。
[0256]
a.向8.5中的0.2mlpcr管中加入120μl65℃预热的1
×
wⅰ洗液。
[0257]
b.短暂旋涡振荡。
[0258]
c.将0.2mlpcr管放在磁力架上，使磁珠与溶液完全分离。
[0259]
d.将0.2mlpcr管放入pcr仪中温浴：65℃，10～20秒。迅速放回磁力架，尽快弃上清。
[0260]
e.使用s-w清洗磁珠。
[0261]
①
向0.2mlpcr管中加入150μl65℃预热的s-w，缓慢吸打10～15次，充分悬浮磁珠。
[0262]
备注：不可剧烈振荡，避免产生气泡。
[0263]
②
将0.2mlpcr管放置于pcr仪进行温浴并准确计时:65℃，5min。
[0264]
③
将0.2mlpcr管放置于磁力架上，使磁珠与溶液完全分离，用移液器迅速弃上清。
[0265]
f.重复e一次，s-w总共清洗磁珠2次。2次s-w洗涤间隔时间尽量短。
[0266]
9.2准备室温洗脱液
[0267]
a.取150μl室温的1
×
wⅰ洗液，加入0.2mlpcr管中，涡旋30秒间隔4次共振荡2min充分悬浮磁珠。
[0268]
b.将0.2mlpcr管放在磁力架上，待磁珠与溶液完全分离，弃上清。
[0269]
c.将150μl室温的1
×
wⅱ洗液，加入0.2mlpcr管中，涡旋30秒间隔2次共振荡1min充分悬浮磁珠。
[0270]
d.将0.2mlpcr管放在磁力架上，待磁珠与溶液完全分离，弃上清。
[0271]
e.将150μl室温的1
×
wⅲ洗液，加入0.2mlpcr管中，涡旋30秒充分悬浮磁珠。
[0272]
f.将0.2mlpcr管放在磁力架上，待磁珠与溶液完全分离，弃上清。
[0273]
9.3重悬磁珠
[0274]
a.将0.2mlpcr管从磁力架上取下。
[0275]
b.加入23μl nuclease-free water.
[0276]
c.使用移液器反复吸打10次，保证所有磁珠重悬。
[0277]
d.将磁珠重悬液转移至新的0.2mlpcr管中。
[0278]
注意：不要丢掉磁珠，含捕获dna的23μl磁珠重悬液用于步骤10的扩增。
[0279]
十.捕获文库pcr富集
[0280]
10.1在0.2mlpcr管中配备pcr反应体系：
[0281]
试剂体积2
×
hifi enzyme25μlprimer-p5p72μl磁珠重悬液(步骤9.3d)23μl总体积50μl
[0282]
10.2简短涡旋振荡，轻甩或瞬时离心，保证磁珠仍悬浮于溶液中。
[0283]
10.3将pcr管放入pcr仪中，热盖105℃，按照如下程序进行pcr扩增：
[0284][0285]
十一.pcr产物纯化
[0286]
11.1配制80％乙醇，每个反应需要100μl。
[0287]
11.2向pcr反应产物中加入50μlagencourt ampure xp beads，涡旋混匀，室温静置5min。
[0288]
11.3将0.2mlpcr管置于磁力架上，使磁珠与溶液完全分离。
[0289]
11.4弃上清。
[0290]
11.5往0.2mlpcr管中加入新鲜配制的100μl80％乙醇，将0.2mlpcr管在磁力架两侧换面，使得磁珠被80％乙醇充分洗涤。
[0291]
11.6充分弃上清，不要有上清液残留。充分晾干或金属浴60℃烘干2min。
[0292]
11.7加入25μl10mm tris-hcl(ph8.0)或0.1
×
te buffer,用移液器充分悬浮磁
珠，静置5min。
[0293]
11.8将0.2mlpcr管置于磁力架上，使磁珠与溶液完全分离。
[0294]
11.9转移上清于新的0.2mlpcr管中，-20℃保存。
[0295]
本研究对16例已知静脉畸形(包括混合静脉畸形)及kt综合征的患者进行遗传学分析，结果如图1所示，采用本方法检测的基因均发生突变，表明样本源发生静脉畸形及相关疾病；该结果与患者实际患病情况相对应，证明本方法可以用于静脉畸形的检测或研究。
[0296]
本发明还对16例静脉畸形(包括混合静脉畸形)及kt综合征分别获取病灶处组织样本，使用硬化剂前的游离dna，以及使用硬化剂(乙醇)后的游离dna，进行高通量测序。16例样本中，通过组织样本的检出人数为11人，通过使用硬化剂(乙醇)前游离dna的检出人数为9人，通过使用硬化剂(乙醇)后后游离dna的检出人数为15人，结果如图2所示，通过使用硬化剂(乙醇)后游离dna检出率显著高于前两者。
[0297]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。