一种调控花青素合成及开花时间的基因HIGD2、蛋白及其应用

一种调控花青素合成及开花时间的基因higd2、蛋白及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种促进调控花青素合成及开花时间的基因higd2、蛋白及其应用。


背景技术：

2.花青素属于类黄酮类化合物，是植物中主要的天然水溶性色素之一，包括花卉、植物及果蔬的呈色，大部分与其有密切联系。花青素具有一定的抗氧化功效，能够清除有害的活性氧自由基，平衡代谢，防止细胞氧化，起到延缓衰老的作用；除此之外，花青素具有抗癌、降血压、保护视力、抗过敏、预防心血管疾病等的作用。随着人类审美观不断的提升，市场对化妆品的需求也日渐趋多。但长期使用合成的化妆品对机体有一定的副作用，所以开发安全、抗衰老、护肤效果佳的天然护肤品成为研究的重要课题，而花青素正好符合这种特质，凭借抗氧化能力和无毒性将会有更广阔的市场。因此，花青素作为一种天然使用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定的营养和药理作用，在食品、化妆品、医药等方面有着巨大的应用潜力。发掘可提高花青素产量的基因可为提取高纯度的花青素以及花色苷类色素奠定基础，为推广和应用花青素提供技术保障。目前花青素的生物合成途径已较为清晰，且相关基因及其功能已研究较为清楚。但是花青素生物合成的调控基因目前主要集中在转录因子的研究上，主要包括myb、bhlh和wd40三类转录因子。这三类转录因子之间可以形成蛋白复合体，通过与植物花青素苷生物合成途径中结构基因启动子的顺式作用元件的结合来调控相关基因的表达。但是由于转录因子往往参与调控途径较多，实际应用较难。
3.植物在上亿年的自然环境生活进化中形成了独特的开花繁殖反应策略，那就是将开花季节限定在一个适宜的时期，以确保子代能够顺利地生长和发育，既植物的光周期现象。大多数植物在自然选择和进化过程都逐渐适应自然光环境的节律，形成明显的最优繁殖的季节性，其中光周期是诱导植物开花重要的环境因子。植物临界日长是指昼夜周期中诱导短日植物开花能忍受的最长日照或诱导长日植物开花所必须的最短日照。对长日照植物，日长大于临界日长，即使24小时都可以开花。但对短日照植物，日长必须小于临界日长才能开花，然而太短也不能开花。如对短日照植物来说北方种子引入南方，要提前开花，需晚熟品种。同样南种北移，需早熟品种；对长日照植物来说北方种子引入南方，要延迟开花，需早熟品种。同样南种北移，需晚熟品种。因此，植物光周期的调控对植物的引种、育种工作有极为重要的意义。
4.综上所述，尽管植物中花青素合成及调控基因研究较多，开花时间的调控和机理亦有诸多报道，但现有技术中对植物花青素的合成及开花时间同时控制机理的研究并不深入，目前仅有3篇文章报道。一个为拟南芥bhlh113基因，该基因突变导致开花时间较野生型晚，花青素含量增多；另一个为小桐子jctps1基因过量表达促进拟南芥长日照下早开花并增加叶片花青素含量。第三个为转基因甘蓝中wd40和tt8表达被抑制后，花青素合成减少，表现早开花的现象。现有技术目前未见报道可以同时提高花青素合成且促进短日照下早开花的基因。因此现有技术难以从单基因层面同时控制植物花青素合成及植物花期。
5.由于植物自身的不可移动性，当遭遇到环境制约时，为响应发育和环境的双重信号，植物可通过复杂的调控网络调整开花时间以维持繁殖成功率。因此，植物响应逆境胁迫的调控网络与开花时间的调控网络可能存在共同的调节枢纽。由于花青素在植物抵抗干旱、低温、盐胁迫、低氮等非生物胁迫及火疫病菌、软腐病菌、黄萎病菌等生物胁迫中也具有重要的作用。因此，本专利涉及的基因及其功能为用基因工程手段改造植物提供优质的基因资源。


技术实现要素：

6.本发明为获得一种可同时调控花青素生物合成及开花时间的关键调控因子，提供一种调控花青素合成及开花时间的基因higd2、蛋白及其应用，可显著提高拟南芥中花青素含量，及在短日照下促进提前开花，过量表达该基因可显著增加植株生物量。
7.为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明提供一种higd2基因的应用，所述higd2基因应用于调控花青素合成或开花时间；所述higd2基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
9.本发明还提供一种higd2蛋白，所述higd2蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
10.本发明还提供上述higd2蛋白的应用，所述higd2蛋白应用于调控花青素合成或开花时间。
11.进一步的，所述植物为拟南芥。
12.本发明还提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体上插入有上述higd2基因。
13.本发明还提供一种重组表达载体构建方法，将higd2基因克隆至pmdc83双元表达载体上，转化至dh5α感受态细胞，提取质粒。
14.本发明还提供一种重组农杆菌，包含上述重组表达载体。
15.本发明还提供一种重组农杆菌的构建方法，其特征在于，将冰冻的农杆菌感受态细胞gv3101解冻后，加入上述重组表达载体；孵育后于无抗lb液体培养基中振荡培养；取上清涂布于卡那霉素lb固体培养基上培养，提取质粒，pcr和酶切鉴定含有目的克隆的农杆菌菌株，将正确的菌株在含有潮霉素的lb液体培养基中培养，得到重组农杆菌。
16.本发明还提供一种提高植物花青素含量的方法，将上述higd2基因导入目的植物中获取转基因植物。
17.本发明还提供一种使植物在短日照下促进提前开花的方法，将上述higd2基因导入目的植物中获取转基因植物。
18.本发明中athigd2基因的突变显著促进拟南芥中花青素的表达，为天然营养品以及天然色素的深入研究与开发提供实验依据，并有助于推广和应用。此外athigd2基因的突变株系在短日照下较野生型开花明显提前，在作物引种和控制植物花期方面将有很大的应用价值。
19.随着人们生活水平的增高，人们都肉制品需求呈递增态势，加快了畜牧业发展的步伐。而我国耕地面积有限，所以增加单位面积牧草的产量将在畜牧业拥有广大的应用前景。恰好在本发明中发现，短日照下，athigd2基因过表达促进了叶片的生长，增加了拟南芥生物量。
20.seq id no.1：
21.maepktkvaeirewiiehklrtvgclwlsgisgsiaynwskpamktsvriiharlhaqaltlaalagaaaveyydhksgatdripkflkpdnlnkd
22.seq id no.2:
[0023]5’
atggcggaaccaaagacaaaagttgcagaaatcagggaatggatcatcgaacataagcttcgtaccgttggttgcttatggctaagtggtatctctggttcaattgcttatattggtctaaacctgccatgaaaaccagtgtcagaatcatccacgctaggttgcatgtcaggcgctgacattagccgctctggctggagcagctgcagtggagtactatgatcaaaatctggagccactgatcgaatcccgaaatttctgaagcctgataacttaaataaggacta g3’。
[0024]
有益效果
[0025]
本发明所述基因和蛋白可显著提高拟南芥中花青素含量，及在短日照下促进提前开花，而过量表达该基因可显著增加植株生物量。
附图说明
[0026]
图1为拟南芥在短日照下生长时，过量表达该基因可导致生物量显著增加；
[0027]
图2为hplc和gc-ms检测对比突变体和野生型中花青素类含量(图2a)。利用分光光度计法分析对比突变体和野生型中花青素类含量(图2b)，结果表明突变体中花青素含量较野生型显著增多，可达野生型的2倍；
[0028]
图3为突变体和野生型在短日照下生长，突变体花期较野生型早(图3a)。野生型约需47天左右抽薹开花，而突变体仅需38天即可抽薹开花(图3b)。其次，开花时突变体莲座叶数目在18片左右，而野生型莲座叶数目达30片左右(图3c)。
具体实施方式
[0029]
下述实施例中所用的方法如没有特殊说明，均为本领域常规方法。
[0030]
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031]
哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)种子购自arabidopsis biological resourcecenter(abrc)，拟南芥t-dna插入突变体higd2,拟南芥过表达athigd2，以上突变体以及过表达株系背景均为col-0生态型。本发明的主要研究基础如下。
[0032]
实施例1：拟南芥t-dna纯合插入突变体鉴定
[0033]
该基因片段的编码区长度为291bp，编码区内含有3个外显子，外显子长度分别为70bp、91bp和130bp。该基因编码96个氨基酸，该蛋白的氨基酸序列顺序表seq id no.1，序列表中seq id no.2为核苷酸序列。我们在tair网站订购了higd2基因的t-dna插入突变体，选择插入位置为该基因的第一个外显子区域。在获得higd2基因的t-dna插入材料后，设计用于鉴定插入纯合的引物进行pcr鉴定。t-dna材料dna提取：取2ml ep管，每株拟南芥剪取1-2cm的叶片置于其中，加入500μl tps溶液，加一颗小钢珠，用粉碎机粉碎叶子。粉碎后的叶子75℃水浴20-30min，12000rpm离心10min，将上清转移置新的1.5ml ep管，加入等量的异丙醇，充分混匀置于-20℃20-30min，12000rpm离心10min。弃上清，加500μl 70％乙醇，12000rpm离心10min。弃上清，干燥。加去离子水溶解dna，取0.8ul做pcr扩增。在凝胶电泳中，我们选出lp+rp扩增结果阴性、lba1+rp扩增结果阳性的植株，确定为athigd2基因t-dna插入纯合体。
[0034]
实施例2：拟南芥higd2基因cdna的克隆与鉴定
[0035]
本发明以拟南芥野生型为材料，提取7天拟南芥幼苗中的rna，rna的提取用rnapure plant kit(dnase i，cat#cw0559s)，反转录按照rna to cdna hiscripi iii rt supermix for qpcr(+gdna wiper)。以合适的引物扩增，扩增产物克隆至pmcd83载体。再进行测序和tair数据库进行比对。
[0036]
实施例3：拟南芥higd2基因过表达植株的获得
[0037]
我们的研究结果表明拟南芥higd2过表达促进拟南芥叶片的生长，增加其生物量。
[0038]
1.拟南芥higd2基因过表达载体的构建
[0039]
将higd2基因克隆至pmdc83双元表达载体上。转化至dh5α感受态细胞，提取质粒。对重组质粒进行pcr和酶切鉴定，以确定阳性克隆，并经测序证实构建的过表达重组载体pmdc83-higd2构建完全正确。
[0040]
2.重组质粒化转转化根瘤农杆菌细胞gv3101及鉴定
[0041]
将重组质粒pmdc83-higd2用化转转化法导入gv3101感受态细胞。将冰冻的农杆菌感受态细胞gv3101在冰上静止5min，解冻感受态细胞。取1μl重组质粒加入50μl感受态细胞中，用手轻轻拨打混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μl无抗lb液体培养基，于28℃250rpm振荡培养3小时。6000rpm离心一分钟收菌，留100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取50μl涂布于50μg/ml卡那霉素lb固体培养基上，28℃倒置培养2-3天。挑选4个农杆菌单克隆置于50μg/ml卡那霉素lb液体培养基培养过夜，提取质粒，pcr和酶切鉴定含有目的克隆的农杆菌菌株，将正确的菌株在含有50μg/ml潮霉素的lb液体培养基中250rpm培养72h，将菌液加入预冷的50％灭菌甘油中保存于-70℃冰箱备用。
[0042]
3.过表达athigd2基因拟南芥株系的获得
[0043]
根据clough and bent(1998)的floral dipping方法进行拟南芥转化(即：将上个步骤制备的含有重组质粒的菌液转化拟南芥)。选择生长状况良好5-10cm的拟南芥植株，去其顶生花序和果荚，刺激腋生花序的生长。一周后可用于转化。转化前一天浇足水。将含有转基因载体的农杆菌gv3101于28℃培养过夜，至od600≈2.0时，4,500rpm离心10min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度od600≈0.8。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中5-15s，确保全部花苞都被浸没。用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收种。转化液：1/2ms和5％蔗糖，0.02％silwet l-77。转基因植株t0种子在含25μg/ml潮霉素的抗性培养基上萌发生长，两周后挑取正常生长的转化苗移入土壤中继续生长。
[0044]
4.过表达higd2基因拟南芥株系的分子鉴定
[0045]
利用ctab的方法提取野生型及转基因植株(所述的植株为拟南芥)基因组dna，以其为模板对转基因植株进行pcr鉴定。转基因植株鉴定引物同基因克隆引物；pcr检测为阳性的转基因植株种子继续抗性筛选，选择抗性分离比例为3:1的单株，按单株收获为t2代株系。然后，再次筛选本代植株抗性为100％为t3代纯合转基因株系，用于进一步的实验。
[0046]
实施例4：拟南芥higd2过表达株系表型分析
[0047]
种子消毒:将拟南芥种子装在1.5或2.0ml的ep管中,每管加适量1-1.5ml消毒水(5％次氯酸钠溶液+0.1％吐温20)，充分混匀，或置于摇床震荡10-15min；离心，4000rpm，30s，去掉清洗液，加无菌水1-1.5ml，混匀1min(种子悬浮),重复无菌水漂洗四次。种植在
2％(w/v)蔗糖和1％(w/v)琼脂的1/2ms固体培养基上。低温(4℃冰箱春化)处理2天。移至短日照人工气候室(光照10小时，黑暗14小时)中萌发生长约7天左右，移栽到人工土壤中继续生长。转基因拟南芥表型初步分析表明，当在拟南芥野生型中过表达higd2时，促进叶片的生长，增加了拟南芥的生物量(图1)。
[0048]
实施例5：拟南芥higd2突变体的表型分析
[0049]
1.higd2基因突变促进拟南芥中花青素的合成
[0050]
拟南芥种子消毒与种植方法同上述实施例3中所述，为减少误差移苗时col-0野生型与higd2突变体种植于同一箔中，置于长日照(光照16小时，黑暗8小时)人工气候室，各种植20株。拟南芥生长2周龄时，停止浇水并放置于强光下继续培养。大约7-10天发现higd2突变与野生型相比，茎基部紫色与叶片下表皮紫色加深(图2a)，在拟南芥中，叶片紫色加深是花青素含量的标志。基于以上发现，对higd2突变体和野生型进行花青素含量测定。采取植物样，记录每株鲜重，置于15ml离心管中，每株加入10ml提取液(甲醇：甲酸：水＝50：3：47)，置于摇床过夜。取上述过夜提取液分别测定在530nm和657nm下的吸光值。用下列计算公式计算花青素含量：花青素含量＝(a530-0.25*a657)/w，数据用excel 2010分析，结果如图2b所示，在强光加干旱处理下，higd2突变体中花青素含量比野生型明显增加2倍左右，这与观察到的higd2突变体中紫色加深一致。
[0051]
hplc-gc-ms检测花青素类物质：取14天拟南芥植株的地上部加液氮研磨成粉末，按1μg:5μl加入提取液(甲醇：盐酸：水＝79：1：20)，涡旋混匀。匀浆12000g离心2min，收集上清。然后立即使用氮吹仪将上清液干燥。用与上清液相同体积的溶解液(甲醇：水＝80：20)重新溶解，用滤头过滤置2ml棕色螺纹广口瓶。hplc在c18柱上进行，流速为0.8ml/min，流动相为(a)1％甲酸水溶液和(b)甲醇。梯度洗脱程序为：0～10min，100～65％a；10～20min，60％a；20～25min，65％～100％a。
[0052]
2.higd2基因突变诱导拟南芥短日照下早开花
[0053]
拟南芥是长日照植物，开花时间在短日照下显著晚于长日照下。拟南芥种子消毒与种植方法同上述实施例3中所述，置于短日照下萌发与培养(光照时长10小时，黑暗14小时)，发现higd2突变体开花时间较野生型明显提前8-9天(图3a)，进一步统计最早出现白色花苞的天数以及此时莲座叶的数目，莲座叶数目相差12片左右(图3b、c)。