细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于生物医学诊断，具体涉及细胞核cnv的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

背景技术：

1、癌症是20世纪最可怕的疾病之一，并在21世纪继续蔓延，发病率不断上升。恶性肿瘤细胞之间是存在异质性的，并表现出不同的生物学特性，这些特性通常是由遗传不稳定性引起的。这种异质性包括功能(多型性)和结构(多型性)的变化。在结构改变中，肿瘤细胞最常见的是核大小和形状、染色质组织、核仁大小和数量以及核仁周围空间的改变。其中细胞核大小的变化一直被细胞病理学家作为一个重要的参数。因此，基于细胞核大小对正常细胞以及肿瘤细胞进行区分，可有效的实现肿瘤细胞基因组信息的获取。

2、众所周知，癌症是一种基因组疾病，癌症感兴趣的基因组畸变大多是体细胞畸变，因为肿瘤产生于正常细胞，其基因组获得性畸变。拷贝数变异(cnv)是癌症中最重要的体细胞畸变之一，因为致癌基因的激活往往归因于染色体拷贝数扩增，而抑癌基因的失活往往是由突变相关的杂合缺失或纯合缺失引起的，其中包括特定dna片段的增殖和缺失。现在大量研究已经发现了cnvs和癌症之间的联系5。因此，体细胞cnv的鉴定对肿瘤预后和改善治疗有重要作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供细胞核cnv的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

2、本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

3、本发明提供了细胞核cnv的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒通过检测细胞核cnv的异常来判定是否为肿瘤。

4、作为优选实施方案，所述肿瘤为泌尿系统肿瘤。

5、作为优选实施方案，所述泌尿系统肿瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌。

6、作为优选实施方案，所述细胞核cnv的检测试剂包括：细胞核dna提取试剂，细胞核dna建库测序试剂、细胞核cnv分析系统。

7、作为优选实施方案，所述细胞核cnv的检测试剂还包括细胞膜裂解试剂和细胞核富集装置。

8、所述的细胞膜裂解试剂可以是市售的试剂盒，也可以是包含triton x-100，chaps，np-40，n-dodecyl-β-d-maltoside，tween-20以及digitonin的任意一种或一种以上任意组合的细胞膜裂解试剂。

9、细胞膜裂解后的溶液，高速离心，收集细胞核。可以采用任意形式的细胞核富集装置实现对细胞核的收集。

10、作为优选实施方案，所述细胞核dna提取试剂选自碱裂解法提取试剂、酚抽提法提取试剂、硅胶膜离心柱提取试剂、磁珠法提取试剂；另外也可选用市售的dna提取试剂。

11、作为优选实施方案，所述细胞核dna建库测序试剂采用市售的微量建库试剂盒进行dna建库；可以是illumina公司的nextera xt dna library preparation kit(货号：fc-131-1024)、neb公司的ultratmii fs dna library prep kit for illumina(货号：e6177)，也可以是kapa公司的kapa hyperplus kit(货号：7962401001)。然后对构建的细胞核dna文库进行测序，双端150，每个样本数据需求量3g。

12、作为优选实施方案，所述细胞核cnv分析系统包括如下分析步骤：

13、1)使用fastp软件对原始测序数据(fastq格式序列)对低质量序列和接头序列的截短去除，评估测序质量，关键参数：-q 25；

14、2)使用bwa软件将过滤过后的测序数据比对到参考基因组(hg19)，使用samtools对bam比对文件按照比对位置进行排序，进一步对bam文件进行重复序列的去除，减少光学重复和pcr重复序列的干扰；

15、3)使用r包qdnaseq对步骤2中获得的bam文件进行固定bin区间内的log2 ratio的计算鉴定，bin区间的大小分别选取500kb和1mb。获得bin区间的log2 ratio后进一步进行segmentation，segmentation方法使用log2-transformation，对cnv进行鉴定。

16、本发明还提供一种肿瘤诊断试剂盒，包括：细胞核dna提取试剂，细胞核dna建库测序试剂、细胞核cnv分析系统。

17、作为优选实施方案，所述肿瘤诊断试剂盒还包括细胞膜裂解试剂和细胞核富集装置。

18、作为一个优选实施方式，本发明对肿瘤细胞细胞核检测cnv的具体步骤为：

19、细胞收集及细胞膜裂解：

20、1)准备尿液样本适量，低速离心，去上清，得细胞沉淀；

21、2)所得细胞沉淀重悬到0.1％的np-40溶液中，震荡孵育15分钟；

22、3)将孵育后的样本，1000g离心10分钟，去除上清，得到的细胞核沉淀使用500ulpbs缓冲液重悬。

23、肿瘤细胞细胞核富集：

24、将上述细胞核重悬液，使用孔径为8um，厚度为5um，孔径间隙为10um的滤膜进行过滤，膜上截留的部分即为富集到的肿瘤细胞核。

25、肿瘤细胞细胞核dna的提取以及文库构建：

26、将富集到肿瘤细胞核使用qiagen公司的微量dna提取试剂盒qiaamp dna microkit(50)(货号：56304)进行dna的提取，详细操作流程见试剂盒说明书。

27、dna文库测序：

28、将得到的细胞核dna使用neb公司的ultratmii fs dna libraryprep kit for illumina(货号：e6177)进行文库构建，详细操作流程见试剂盒说明书。将制备好的文库送明码生物进行测序，双端150，每个样本数据需求量3g。

29、细胞核cnv分析：

30、1)使用fastp软件对原始测序数据(fastq格式序列)对低质量序列和接头序列的截短去除，评估测序质量，关键参数：-q 25。

31、2)使用bwa软件将过滤过后的测序数据比对到参考基因组(hg19)，使用samtools对bam比对文件按照比对位置进行排序，进一步对bam文件进行重复序列的去除，减少光学重复和pcr重复序列的干扰。

32、3)使用r包qdnaseq对步骤2中获得的bam文件进行固定bin区间内的log2 ratio的计算鉴定，bin区间的大小分别选取500kb和1mb。获得bin区间的log2 ratio后进一步进行segmentation，segmentation方法使用log2-transformation，对cnv进行鉴定。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

34、本发明通过检测肿瘤细胞细胞核dna的cnv来实现对肿瘤的诊断。本发明通过实验发现：细胞核cnv的检测可以用来区分膀胱癌患者与膀胱良性病变患者，并且相对于直接检测尿脱落细胞dna的cnv，针对细胞核的cnv检测对于肿瘤诊断具有更高的准确性。