预测肺腺癌患者对免疫疗法敏感性的生物标志物、应用和装置的制作方法

1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种预测肺腺癌患者对免疫疗法敏感性的生物标志物、应用和装置。


背景技术：

2.非小细胞肺癌是最常见的肺癌种类，约占肺癌的85％。非小细胞肺癌又可根据组织结构的不同分为三种主要的亚型，包括肺腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，其中，肺腺癌是非小细胞肺癌的最常见类型，占了非小细胞肺癌的47％。
3.近年来，免疫疗法开启了肺癌治疗的新篇章，其中免疫检查点抑制剂更是肿瘤治疗领域的“明星”药物，已经进入非小细胞肺癌的一线治疗，显著改善了晚期肺癌患者的治疗现状。然而整体单药有效率较低，且费用较高，还经常有不良反应甚至超进展。因此，需要生物标志物来筛选免疫检查点抑制剂疗法的获益人群。
4.pd-l1和tmb(肿瘤突变负荷，tumor mutational burden)是fda或nccn指南推荐的免疫治疗生物标志物。然而，pd-l1的表达具有动态变化的特点，导致pd-l1表达与免疫治疗效果之间的关系仍有一些争议，并且多个临床试验结果显示pd-l1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分pd-l1阴性患者依然能从免疫治疗中获益。此外，尽管大量随机对照研究和大样本真实世界研究都已证实tmb与免疫疗效之间的相关性，但tmb依然只能反映肿瘤突变数量，而不能提示肿瘤微环境的状态，且tmb检测对技术平台要求较高、工作周期较长和成本较高都制约其临床应用。


技术实现要素：

5.本发明研究发现，特定基因突变可能是指导肺腺癌免疫检查点抑制剂治疗的预测标志物，能够精准筛选免疫检查点抑制剂疗法的获益人群。基于此，有必要提供一种预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的生物标志物。
6.预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的生物标志物，包括突变型细胞分化调控基因，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种，上述突变型是错义突变和/或无义突变。
7.上述预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的生物标志物，细胞分化调控基因中的zfhx3和/或ptprd基因的突变型，包括无义突变和/错义突变，与tmb值存在显著相关性，能够作为新的生物标志物预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法的敏感性，能够精准筛选免疫检查点抑制剂疗法的获益人群，节约检测成本。
8.此外，还提供一种上述生物标志物在制备预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性或肿瘤突变负荷程度的试剂或试剂盒中的应用，一种用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的装置，一种计算机设备和一种计算机存储介质。
9.在其中一个实施例中，上述突变型的突变位点包括以下位点中的至少一个：zfhx3
基因的p.e858*、p.l3091i、p.c1144f、p.d3665v、p.g2893r、p.p1255s、p.q149*、p.l1315v、p.e510d、p.s2098l、p.t813s、p.a188s、p.s3601l、p.s3654l和p.g210c位点，以及ptprd基因的p.g1213e、p.e698q、p.f850l、p.r1674s、p.l984f、p.y1191c、p.s306*、p.e21q、p.p1525t、p.g1835a、p.s667l、p.p519t、p.t1100k、p.g1418w、p.g761c、p.d473v、p.a1413d、p.m1864k、p.e1639*、p.p1520t、p.e118k、p.s896l、p.p1839r、p.g1152v、p.t706k、p.y1386*、p.t376r、p.t1738s和p.d473y位点。
10.在其中一个实施例中，上述突变型的突变位点包括以下共突变位点中的至少一组：zfhx3基因的p.d3665v位点和ptprd基因的p.y1191c位点、zfhx3基因的p.g2893r位点和ptprd基因的p.e21q位点、zfhx3基因的p.p1255s位点和ptprd基因的p.p1525t位点、zfhx3基因的p.e510d位点和ptprd基因的p.a1413d位点、zfhx3基因的p.s2098l位点和ptprd基因的p.p1520t位点或zfhx3基因的p.s3601l位点和ptprd基因的p.t376r位点。
11.在其中一个实施例中，上述免疫检查点包括pd-1、pd-l1或ctla4。
12.在其中一个实施例中，上述试剂或试剂盒用于核酸水平或蛋白水平的检测。
13.在其中一个实施例中，上述试剂或试剂盒用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、高分辨率熔解法、以及氨基酸测序法。
14.在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括样品的处理试剂，该样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
15.一种用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的装置，包括：
16.数据获取模块，用于获取受试者细胞分化调控基因的突变情况，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种；
17.输出预测模块，用于根据上述受试者的突变情况中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，输出该受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果。
18.在其中一个实施例中，上述根据受试者的突变情况中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，输出该受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果是，若上述突变情况zfhx3和ptprd基因中至少有一个基因存在错义突变或无义突变的目标位点，说明该受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感，否则，则说明该受试者对免疫检查点抑制剂疗法不敏感。
19.一种计算机设备，具有处理器和存储器，该存储器上存储有计算机程序，该处理器执行上述计算机程序时实现预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的全部步骤，上述步骤包括：
20.获取受试者细胞分化调控基因的突变情况，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种；
21.根据上述受试者的突变情况输出受试者中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果。
22.一种计算机存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被执行时实现预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的全部步骤，该步骤包括：
23.获取受试者细胞分化调控基因的突变情况，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种；
24.根据上述受试者的突变情况中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，输出受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果。
附图说明
25.图1为zfhx3基因突变与tmb的关系图；
26.图2为ptprd基因突变与tmb的关系图；
27.图3为tmb高低分组的zfhx3和ptprd基因突变情况统计结果；
28.图4为cdrs分组与tmb的关系图；
29.图5为group分组与tmb的关系图；
30.图6为根据cdrs分组绘制的生存曲线；
31.图7为根据sum分组绘制的生存曲线；
32.图8为根据comut分组绘制的生存曲线；
33.图9为根据tmb分组绘制的生存曲线；
34.图10～图12为包括zfhx3和ptprd基因突变情况、性别、年龄、治疗药物类型和肿瘤突变负荷的基于多因素cox的回归分析；
35.图13为基于多因素cox回归对zfhx3和ptprd基因突变建立的不同临床获益评估的预测模型。
具体实施方式
36.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
37.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
38.本文所述的术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。
39.本发明研究发现，特定基因突变可能是指导肺腺癌免疫检查点抑制剂治疗的预测标志物，能够精准筛选免疫检查点抑制剂疗法的获益人群。基于此，有必要提供一种预测肺腺癌患者对免疫疗法敏感性的生物标志物。
40.预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的生物标志物，包括突变型细胞分化调控基因，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种，上述突变型是错义突变和/或无义突变。
41.上述预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的生物标志物，细胞分化调控基因中的zfhx3和/或ptprd基因的突变型，包括无义突变和/错义突变，与tmb值存在显著
相关性，能够作为新的生物标志物预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法的敏感性，能够精准筛选免疫检查点抑制剂疗法的获益人群，节约检测成本。
42.本技术一实施方式还提供了一种上述生物标志物在制备预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性或肿瘤突变负荷程度的试剂或试剂盒中的应用。
43.在其中一个实施例中，上述突变型的突变位点包括以下位点中的至少一个：zfhx3基因的p.e858*、p.l3091i、p.c1144f、p.d3665v、p.g2893r、p.p1255s、p.q149*、p.l1315v、p.e510d、p.s2098l、p.t813s、p.a188s、p.s3601l、p.s3654l和p.g210c位点，以及ptprd基因的p.g1213e、p.e698q、p.f850l、p.r1674s、p.l984f、p.y1191c、p.s306*、p.e21q、p.p1525t、p.g1835a、p.s667l、p.p519t、p.t1100k、p.g1418w、p.g761c、p.d473v、p.a1413d、p.m1864k、p.e1639*、p.p1520t、p.e118k、p.s896l、p.p1839r、p.g1152v、p.t706k、p.y1386*、p.t376r、p.t1738s和p.d473y位点。
44.在一个可选的具体示例中，上述突变型的突变位点包括以下共突变位点中的至少一组：zfhx3基因的p.d3665v位点和ptprd基因的p.y1191c位点、zfhx3基因的p.g2893r位点和ptprd基因的p.e21q位点、zfhx3基因的p.p1255s位点和ptprd基因的p.p1525t位点、zfhx3基因的p.e510d位点和ptprd基因的p.a1413d位点、zfhx3基因的p.s2098l位点和ptprd基因的p.p1520t位点或zfhx3基因的p.s3601l位点和ptprd基因的p.t376r位点。
45.在其中一个实施例中，上述免疫检查点包括pd-1、pd-l1或ctla4。
46.在其中一个实施例中，上述试剂或试剂盒用于核酸水平或蛋白水平的检测。鉴于zfhx3或ptprd基因为一种能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和反应水平上，本领域技术人员可以从dna水平直接检测或从rna和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生突变，这些都可以应用于本发明。
47.核酸水平(dna或rna水平)的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该dna或rna杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。并且本领域技术人员也容易想到将mrna反转录成cdna后对cdna进行检测，这些技术手段的常规置换不超出本发明的保护范围。
48.在其中一个实施例中，上述试剂或试剂盒用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、高分辨率熔解法以及氨基酸测序法。
49.具体地，聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、taqman探针法、竞争性等位基因特异性pcr和等位基因特异性pcr。核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。
50.在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括样品的处理试剂，该样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
51.在一些实施方式中，所述样品选自肺腺癌患者的血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。其中，优选的检测样品为血液、血清、血浆，更优选的它们来自外周血。
52.在一些实施方式中，所述组织为肺癌组织或癌旁组织。
53.本技术实施方式还提供一种用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法，包括步骤a1和步骤a2：
54.步骤a1：获取受试者细胞分化调控基因的突变情况，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种；
55.具体地，获取的受试者的细胞分化调控基因的突变情况，可以是zfhx3和ptprd基因中至少一个基因的至少一个突变位点的数据，也可以是基因突变的组合。
56.步骤a2：根据上述受试者的突变情况中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，输出受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果。
57.在其中一个实施例中，上述根据受试者的突变情况中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，输出该受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果是，若zfhx3和ptprd基因中至少有一个基因存在错义突变或无义突变的目标位点，说明该受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感，否则，则说明该受试者对免疫检查点抑制剂疗法不敏感。具体地，受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感体现为该受试者能从免疫检查点抑制剂疗法中获益，对癌症能起到治疗作用。
58.基于与上述预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法相同的思想，本技术一实施方式还提供一种用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的装置，包括数据获取模块和输出预测模块。
59.具体地，数据获取模块，用于获取受试者细胞分化调控基因的突变情况，该细胞分化调控基因选自zfhx3和ptprd基因中的至少一种。
60.输出预测模块，用于根据上述受试者中是否存在错义突变和/或无义突变的突变型，的突变情况输出该受试者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测结果。
61.本发明还提供了一种计算机设备，具有处理器和存储器，存储器上存储有计算机程序，该处理器执行上述计算机程序时实现上述任一实施例中预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法的全部步骤。
62.据此，本发明一实施方式还提供了一种计算机存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被执行时实现上述任一实施例中预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法的全部步骤。
63.本领域普通技术人员可以理解实现上述方法中的全部或部分流程，是可以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，所述的计算机程序可存储于一非易失性的计算机可读取存储介质中，该计算机程序在执行时，可包括如上各方法的实施例的流程。其中，本技术所提供的各实施例中所使用的对存储器、存储、数据库或其他介质的任何引用，均包括非易失性和易失性存储器中的至少一种。非易失性存储器可包括只读存储器(read-only memory，rom)、磁带、软盘、闪存或光存储器等。易失性存储器可包括随机存取存储器(random access memory，ram)或外部高速缓冲存储器。作为说明而非局限，ram可以是多种形式，比如静态随机存取存储器(static random access memory，sram)或动态随机存取存储器(dynamic random access memory，dram)等。
64.为了说明发明的生物标志物预测免疫检查点抑制剂疗法敏感性的可行性，在此采用212例肺腺癌患者的数据作为案例分析。
65.实施例1
66.1.数据获取
67.从mskcc数据库中获取271例经免疫检查点抑制剂疗法(pd-1/pdl-1；combo；
ctla4)治疗的晚期肺腺癌患者的数据，其中包括基因突变数据、tmb数据、治疗方案数据和总生存期数据。筛选总生存月份大于等于3个月的晚期肺腺癌病人共212例，用于开展后续的数据分析。
68.细胞分化调控基因zfhx3和ptprd在212例经过免疫治疗的肺腺癌患者中的突变频率分别为8.49％和14.6％。分析发现，zfhx3和ptprd基因存在显著的共突变现象(p《0.05)，即两个基因同时发生突变，具体见表1。
69.表1
[0070][0071]
2.分析zfhx3和ptprd基因集与tmb的关系
[0072]
进一步根据zfhx3和ptprd基因突变类型定义突变分组，将在zfhx3和ptprd基因中至少有一个基因发生无义突变(nonsense_mutation)或错义突变(missense_mutation)，归为cdrs＝1组，具体突变位点见表2。若zfhx3和ptprd基因发生移码突变(frame_shift_del/frame_shift_ins)、缺失突变(in_frame_del)或剪接位点突变(splice_site)中任意一种体细胞非同义突变，或者发生体细胞同义突变或仅在非编码区发生突变，则归为cdrs＝0组。
[0073]
表2
[0074]
[0075]
[0076][0077]
分析单指标zfhx3或ptprd基因与tmb的相关性，如图1和图2所示。从图1～图2中可知，单指标zfhx3基因或ptprd基因发生突变均与tmb有显著的正相关关系。此外，图3显示tmb高低分组的zfhx3和ptprd基因突变情况统计，图中的“tmb_h_mut”是指tmb值高的突变型，“tmb_l_mut”是指tmb值低的突变型，“tmb_h_wt”是指tmb值高的野生型，“tmb_l_wt”是指tmb值低的野生型，or值表示突变型的tmb值高的风险是野生型的倍数。但根据图4的cdrs组与tmb的关系可知，cdrs＝1分组的中位tmb值与单指标zfhx3基因或ptprd基因发生突变相比，前者均高于后两者，提示zfhx3和ptprd基因中至少有一个基因发生无义突变或错义突变与tmb值的相关性可能更强。
[0078]
为了进一步优化突变组合与tmb的关系，将zfhx3-wt且ptprd-wt定义为group＝0，zfhx3-mut或ptprd-wt，zfhx3-wt或ptprd-mut定义为group＝1，zfhx3-mut且ptprd-mut定义为group＝2，结果发现group＝2时中位tmb值显著高于其他分组(如图5所示)。其中group＝2组的突变位点如表3所示。
[0079]
表3
[0080][0081][0082]
3.建立生存模型
[0083]
图6为根据cdrs分组绘制的生存曲线，相比cdrs＝0组，cdrs＝1组总生存时间有显著差异(p《0.01，hr(hazard ratio)＝0.59，95％ci，0.39～0.89)。
[0084]
此外，将zfhx3和ptprd基因中任何一个基因发生体细胞非同义突变归为sum＝1分组，反之归为sum＝0分组。图7为根据sum分组绘制的生存曲线，将图7与图8对比可知，经过免疫治疗的肺腺癌患者中cdrs＝1分组患者的12个月生存率(79.8％，p《0.01)比sum＝1分组患者的12个月生存率高(77.5％，p＝0.02)，说明cdrs分组比sum分组可能更能提示肺腺癌患者对免疫治疗的敏感性。
[0085]
进一步，将zfhx3和ptprd同时出现任意一种错义突变或无义突变时，归为comut＝
1分组，若zfhx3和ptprd基因同时或者部分发生移码突变、缺失突变或剪接位点突变任意一种体细胞非同义突变，或者zfhx3和ptprd不同时出现无义突变或错义突变，或者发生体细胞同义突变或仅在非编码区发生突变，则归为comut＝0组。图8为根据comut分组绘制的生存曲线，从图9中可知，现有数据zfhx3和ptprd共突变的患者一直没有到达终点，表现出更长的存活时间(p＝0.024)，并且当zfhx3和ptprd出现共突变时患者的中位os比cdrs＝1组、sum＝1组的中位存活时间都要长。
[0086]
综上，图6～图8说明，cdrs＝1分组与接受免疫治疗的肺腺癌患者的较长中位存活时间密切相关，优选的comut＝1分别与cdrs＝1分组和cdrs＝0分组相比或许能够更有效预测肺腺癌患者接受免疫治疗的敏感性。
[0087]
另外，2019年v1版的nccn肺腺癌指南中就已将tmb作为潜在可指导免疫治疗的分子标志物纳入指南，用于指导“nivolumab+ipilimumab”双药联合治疗和“nivolumab”单药治疗的肺腺癌患者。因此，同时对tmb分组进行生存曲线绘制(见图9)。从图9中可知，在经过免疫治疗的212例肺腺癌患者的生存分析中，发现tmb-h组的中位存活时间为36个月，而tmb-l组中位存活时间为15个月(95％ci，12～23)。12个月的存活时间率分别为63.2％和57.1％。
[0088]
4.基于多因素cox回归验证cdrs对预测晚期肺腺癌患者对免疫治疗的敏感性
[0089]
除了zfhx3和ptprd基因突变情况，同时将获取的临床信息指标(包括性别、年龄、治疗药物类型和肿瘤突变负荷)纳入分析，开展多因素cox回归分析，结果如图10～图12所示。从图10和图11中可知，cdrs＝1的分组与sum＝1的分组均可作为独立因素用来预测经免疫治疗的肺腺癌患者的敏感性(p《0.01)，且结果显示cdrs＝1分组相对优于sum＝1的分组。而从图12中发现，tmb作为独立因素在经免疫治疗的肺腺癌患者中预测获益人群不具有显著的统计意义。
[0090]
5.基于多因素cox回归的决策曲线分析评估预测晚期肺腺癌患者对免疫治疗的敏感性的最优突变集合
[0091]
基于多因素cox回归对zfhx3和ptprd基因突变建立2个不同的临床获益评估的预测模型(如图13所示)。图例中sum是基于现有的sum分组建立的临床获益模型，cdrs是基于cdrs分组建立的临床获益模型。结果显示cdrs与sum模型的临床获益基本一致，这说明本技术的cdrs模型可以有效的去除冗余信息，对现有的组合进行了合理有效的优化，将影响临床获益的权重大的特征成功的筛选了出来，为预测肺腺癌患者免疫治疗敏感性提供最优的突变组合。
[0092]
另外，尽管现有数据中comut＝1分组的患者没有到达终点事件，导致无法利用决策曲线分析临床获益情况，但是从comut分组建立的生存模型中，可以看出comut＝1的分组患者存活时间更长，且具有显著的统计学意义(p《0.01)。因此可以推测comut分组或许比现有sum分组和cdrs分组有更好的临床获益。这一发现或许将为后续临床试验的开展提供方向。
[0093]
综上分析，在经免疫治疗的晚期肺腺癌患者中，cdrs基因集作为生物标志物，能够有效预测晚期肺腺癌患者免疫治疗敏感的获益人群。优选的，当zfhx3和ptprd发生共突变时即comut基因集(zfhx3-mut且ptprd-mut)或许能够更加有效的预测晚期肺腺癌患者经免疫治疗的敏感性(p《0.01)。换言之，在现有数据中显示，cdrs可以有效预测肺腺癌患者肿瘤
突变负荷程度，也可以预测肺腺癌患者免疫检查点抑制剂疗法的敏感性，而comut组合临床获益效果更佳鉴于数据的局限性或许该发现可以为后续临床试验的开展提供新方向。
[0094]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0095]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。