一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。


背景技术：

2.霉菌毒素污染是当前饲料领域一个普遍存在的较为严重的问题，其中，黄曲霉毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等毒素严重威胁动物的健康。目前，霉菌毒素的降解方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和微生物脱毒法，其中，主要是物理和化学脱毒法的应用较为普遍，但这两种方法可能会影响饲料的感官特征和品质等，从而限制其广泛使用。微生物脱毒法是近些年才开始研究的一种新兴方法，该方法的优点在于，在不会对饲料品质和感官特征产生明显影响的情况下，去除霉菌毒素，同时不会造成二次污染问题。
3.玉米赤霉烯酮是一种雌激素类似物，其会竞争性地与哺乳动物的雌激素受体结合，从而导致动物的不育和生殖疾病。除了生殖毒性，玉米赤霉烯酮还可能会导致肝毒性、免疫毒性、遗传毒性等不同的问题。
4.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilus)是一种革兰氏阳性菌，目前，枯草芽孢杆菌已正式列入饲料添加剂目录。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)zj-2019-1及其在降解玉米赤霉烯酮方面的用途。
6.具体地，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)zj-2019-1，该菌株已于2021年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.23636。
8.本发明提供含有所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1的菌剂。
9.以上所述的菌剂可为固体菌剂或液体菌剂。
10.除含有枯草芽孢杆菌zj-2019-1外，所述菌剂还可含有微生物制剂领域允许的辅料，例如：冻干保护剂、吸附剂等。
11.以上所述的菌剂可采用以下方法制备得到：
12.(1)将枯草芽孢杆菌zj-2019-1经活化后接种于种子培养基中培养，获得种子液；
13.(2)将步骤(1)的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
14.(3)将发酵液直接制备为菌剂或与辅料混合制备为菌剂。
15.以上所述方法中，发酵培养基优选包括以下组分：葡萄糖0.5～1％，酵母提取物0.5～2％，蛋白胨1～2％，硫酸锰0.001～0.01％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸镁0.05～0.5％，ph 5.5～7.0。
16.发酵培养条件优选为：发酵温度30-45℃，转速160-200r/min，ph 7.0-7.4，发酵时间16-24h。更优选为：发酵温度37℃，转速180r/min，发酵时间24h。
17.本发明提供一种发酵物，其由所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1经发酵培养制备得到。
18.以上所述的发酵物中含有选自枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌体、灭活菌体、枯草芽孢杆菌zj-2019-1的代谢产物以及发酵培养基成分中的一种或多种。
19.其中，枯草芽孢杆菌zj-2019-1的代谢产物包括胞内或胞外蛋白酶。
20.优选地，本发明提供上述发酵物的制备方法，其包括以下步骤：
21.(1)将枯草芽孢杆菌zj-2019-1经活化后接种于种子培养基中培养，获得种子液；
22.(2)将步骤(1)的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
23.(3)将步骤(2)得到的发酵液离心，收取上清液，将上清液通过滤膜过滤，得到滤液，将滤液于-75～-85℃冷冻1～3h后，冷冻干燥24～72h，得到的冻干粉末复溶于缓冲液，冻干浓缩得到活性蛋白粗提物，即为所述发酵物。
24.以上步骤(1)中，种子液中枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌浓度为109cfu/ml。
25.以上步骤(2)中，种子液的接种比例为1～5％，优选为2％。
26.以上步骤(2)中，发酵培养基优选包括以下组分：葡萄糖0.5～1％，酵母提取物0.5～2％，蛋白胨1～2％，硫酸锰0.001～0.01％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸镁0.05～0.5％，ph 5.5～7.0。
27.发酵培养条件优选为：发酵温度30-45℃，发酵时间16-24h，转速160-200r/min，ph 7.0-7.4。更优选为：发酵温度37℃，转速180r/min，发酵时间24h。
28.以上步骤(3)中用于复溶的缓冲液优选为pbs缓冲液。
29.本发明发现，枯草芽孢杆菌zj-2019-1、其菌悬液、其发酵液以及其发酵物具有高效降解玉米赤霉烯酮的活性。本发明发现采用蛋白酶对枯草芽孢杆菌zj-2019-1的菌悬液、其发酵液以及其发酵物进行降解处理后，其降解玉米赤霉烯酮的活性会消失，因此，枯草芽孢杆菌zj-2019-1可通过分泌可降解玉米赤霉烯酮的活性蛋白对玉米赤霉烯酮进行降解。
30.基于上述功能，本发明提供一种玉米赤霉烯酮降解剂，其含有所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1或所述菌剂或所述发酵物。
31.本发明还提供一种饲料或饲料添加剂，其含有所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1或所述菌剂或所述发酵物。
32.本发明提供所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)zj-2019-1或所述菌剂或所述发酵物在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
33.优选地，所述应用具体为降解饲料、粮油、农产品中的玉米赤霉烯酮。
34.本发明提供所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1或所述菌剂或所述发酵物在制备用于降解玉米赤霉烯酮的产品中的应用。
35.本发明提供一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其为采用所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1或所述菌剂或所述发酵物对含有玉米赤霉烯酮的产品进行处理。
36.优选地，含有玉米赤霉烯酮的产品优选为饲料、粮油、农产品。
37.具体地，所述方法为将所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1、其发酵液或其菌悬液或所述菌剂或所述发酵物与含有玉米赤霉烯酮的产品混合，得到反应体系，将所述反应体系于30-45℃进行处理。
38.优选地，处理温度为36-38℃。
39.优选地，反应体系的初始ph为5.0-9.0。更优选为5.0-7.5。
40.优选地，所述降解玉米赤霉烯酮的方法包括：将所述枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵液与含有玉米赤霉烯酮的产品混合，得到反应体系，将反应体系的ph调至5.0-9.0，于30-45℃，转速160-200r/min，反应24h-72h；或者，将所述发酵物溶于0.01mol/l pbs缓冲液中，得到活性蛋白溶液，将活性蛋白溶液或其冻干物与含有玉米赤霉烯酮的产品混合，于30-45℃，转速160-200r/min，反应24h-72h。
41.本发明的有益效果在于：本发明提供的枯草芽孢杆菌zj-2019-1能够高效降解玉米赤霉烯酮毒素，降解率可达到约100％，解毒活性高，可用于饲料等产品中玉米赤霉烯酮毒素的降解，极大地降低了玉米赤霉烯酮对动物繁殖性能等的危害，改善动物生产性能，且不会影响饲料的感官特征。同时，枯草芽孢杆菌在饲料添加剂允许目录中，对环境没有污染，枯草芽孢杆菌zj-2019-1具有较强的抗逆性，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
42.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
43.以下实施例中使用的改良lb液体培养基的配方如下：葡萄糖1％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，硫酸锰0.005％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，ph 7.0。
44.实施例1菌株的筛选、分离与鉴定
45.枯草芽孢杆菌zj-2019-1的筛选、分离和鉴定的主要过程如下：
46.1、采取河北邢台某养殖场粪便样品10g，置于100ml改良lb液体培养基中，160r/min，37℃富集培养24h，得到菌液。将菌液放置80℃处理10min后涂板，于37℃培养24h。
47.2、菌株的纯化
48.挑取单个菌落分别进行染色、镜检，对其中的革兰氏阳性、杆状的细菌划线分离纯化，并保存。
49.3、菌株的筛选
50.将菌株按照上述1中的培养条件进行培养，得到发酵液，取发酵液与一定浓度的玉米赤霉烯酮进行混合处理，并放置一定时间后，测定玉米赤霉烯酮的含量，挑选出玉米赤霉烯酮含量最低的处理菌株，最终得到一株具有高效降解玉米赤霉烯酮能力的菌株，将其命名为菌株zj-2019-1。
51.4、菌株的鉴定
52.将纯化得到的菌株zj-2019-1进行培养，取对数生长期的新鲜菌液，送至生物公司提取16s rdna并进行序列测定，该菌株的16s rdna全长序列为1356bp(如seq id no.1所示)，与枯草芽孢杆菌的16s rdna的相似度为99％，根据该菌株的形态和16s rdna序列，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌zj-2019-1。
53.5、菌株的生物保藏
54.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)zj-2019-1已于2021年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.23636。
55.实施例2枯草芽孢杆菌zj-2019-1的培养和发酵液制备
56.枯草芽孢杆菌zj-2019-1的培养方法如下：
57.(1)将枯草芽孢杆菌zj-2019-1经活化后接种于种子培养基中培养，获得种子液，种子液中枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌浓度为109cfu/ml；
58.种子培养基的配方如下：葡萄糖1％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，硫酸锰0.005％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，ph 7.0。
59.(2)将步骤(1)得到的种子液按照2％的接种比例接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
60.发酵培养基为改良lb液体培养基；
61.发酵培养条件为：发酵温度37℃，转速180r/min，发酵时间24h。
62.实施例3枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵物的制备
63.枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵物的制备方法如下：
64.(1)将枯草芽孢杆菌zj-2019-1经活化后接种于种子培养基中培养，获得种子液，种子液中枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌浓度为109cfu/ml；
65.种子培养基的配方如下：葡萄糖1％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，硫酸锰0.005％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，ph 7.0。
66.(2)将步骤(1)得到的种子液按照2％的接种比例接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
67.发酵培养基为改良lb液体培养基。
68.发酵培养条件为：发酵温度37℃，转速180r/min，发酵时间24h。发酵液中枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌浓度为109cfu/ml。
69.(3)将步骤(2)得到的发酵液离心，收取上清液，将上清液通过0.22μm滤膜过滤，得到滤液，分装到50ml的离心管中，用锡纸封口，放置于-80℃冷冻2h后，冷冻干燥48h，将得到的冻干粉末复溶于pbs缓冲液，冻干浓缩得到活性蛋白粗提物，即为枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵物。
70.实施例4枯草芽孢杆菌zj-2019-1降解玉米赤霉烯酮
71.本实施例采用枯草芽孢杆菌zj-2019-1降解玉米赤霉烯酮，具体方法如下：
72.1、按照实施例2的方法制备枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵液，发酵液中枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌浓度为109cfu/ml。按照实施例3的方法制备枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵物；
73.2、将步骤1的发酵液按照体积比1％的接种量与初始浓度为10mg/ml的玉米赤霉烯酮混合，将发酵物按照质量体积比1％与初始浓度为10mg/ml的玉米赤霉烯酮混合，置于不同温度、ph条件下培养，检测不同处理条件下枯草芽孢杆菌zj-2019-1对玉米赤霉烯酮的降解率。
74.其中，玉米赤霉烯酮的浓度检测方法为高效液相色谱法，具体条件如表1所示。
75.表1高效液相色谱法检测玉米赤霉烯酮的条件
[0076][0077]
玉米赤霉烯酮的降解率的降解率的计算公式如下：(初始霉菌毒素含量-降解后霉菌毒素含量/初始霉菌毒素含量)*100％。
[0078]
玉米赤霉烯酮的降解率的检测结果如表2所示，结果表明，枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵液对玉米赤霉烯酮的降解率可达到95.6％，枯草芽孢杆菌zj-2019-1的发酵物对玉米赤霉烯酮的降解率可达到99.2％。以上结果表明，枯草芽孢杆菌zj-2019-1及其发酵液、发酵物均具有高效的玉米赤霉烯酮降解活性。
[0079]
表2不同处理条件对玉米赤霉烯酮降解率的影响
[0080][0081]
实施例5饲料中添加枯草芽孢杆菌对母猪生产性能的影响
[0082]
试验分为三个处理组，对照处理组(c组)饲喂未被玉米赤霉烯酮污染的日粮，t1处理组饲喂玉米赤霉烯酮污染日粮(zen含量为970μg/kg日粮)，t2处理组在饲喂玉米赤霉烯酮污染日粮基础上添加枯草芽孢杆菌zj-2019-1菌液，添加剂量为180ml/天(菌液中枯草芽孢杆菌zj-2019-1的活菌浓度为109cfu/ml)。各处理组设置6个重复，每个重复1头母猪，预饲期7天，试验期为21天。实验结果如表3所示。
[0083]
表3不同处理对母猪生产性能的影响
[0084]
[0085]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。