快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法与流程

1.本发明涉及农业生物技术领域。更具体地说，本发明涉及快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法。


背景技术：

2.黄河鲤是我国黄河流域长期自然形成的特有经济鱼类，同松江鲈鱼、兴凯湖鲌鱼、松花江鲑鱼并称为我国四大名鱼，自古以来被视为食之上品，以金鳞赤尾、体态优美、肉质细嫩鲜美而驰名。近年来由于环境变化、人为因素等使黄河鲤种质资源遭到严重破坏，加上高密度集约化的养殖条件，引发鲤鱼种质混杂，养殖的黄河鲤中出现了红色个体。红色黄河鲤体色迥异于野生型黄河鲤，难以被消费者接受，对黄河鲤选育和产业产生一定的负面干扰。
3.红色黄河鲤个体的出现是由于在养殖历史过程中，黄河鲤种群中混杂了一定比例的隐性红色突变等位基因，经过不断地自交及与其它种群杂交，使得该隐性基因在群体中得以保留并出现了隐性纯合个体，表型为红色，但是携带该红色突变等位基因的亲鱼表型为正常体色，无法从外部形态上辨别，因此无法彻底清除该性状。目前为止没有相关分子技术来鉴定黄河鲤是否携带隐性红色突变等位基因，严重影响了黄河鲤的育种。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法，只需少量组织比如鳍条，就可以快速鉴定黄河鲤亲鱼是否携带体色突变等位基因，从而防止产生红色突变的子代。
5.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了采用pcr法鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的引物对，所述引物对由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物序列为：ttagatgactgatcgcttccta，下游引物序列为：
6.tgtatgtatgccgtacctgat。
7.快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法，包括：
8.1)提取样本dna；
9.2)pcr扩增
10.使用特异性引物对步骤1)所提取的dna进行pcr扩增，所用引物序列为：
11.上游引物序列ttagatgactgatcgcttccta
12.下游引物序列tgtatgtatgccgtacctgat；
13.3)对步骤2)的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
14.4)根据凝胶电泳图谱中的条带情况对黄河鲤进行鉴定
15.凝胶电泳图谱中512bp和468bp处各显示一条带的为携带红色突变等位基因的黄河鲤。
16.优选的是，所述的快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法中，pcr体系
为：2
×
es taq mastermix 20微升，样本dna2微升，浓度为10μm的上游引物1微升，浓度为10μm的下游引物1微升，无菌水16微升；
17.pcr过程为：94℃4min变性；94℃30s预热，60℃30s偶联，72℃45s延伸，30个循环；72℃10min延伸；4℃保存。
18.优选的是，所述的快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法中，所述步骤3)中将pcr扩增产物用质量体积比为2％的琼脂糖凝胶在80v电压下电泳1小时。
19.用于快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的pcr扩增试剂，所述扩增试剂包含上述引物对。
20.上述引物对在鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤中的应用。
21.本发明至少包括以下有益效果：
22.本发明在不将鱼处死的前提下，只需少量组织比如鳍条，就可以快速鉴定黄河鲤亲鱼是否携带体色突变等位基因，从而防止产生红色突变的子代。该成果能应用于黄河鲤选育，快速筛选出种质纯合的黄河鲤用作亲本进行繁育，排除红色隐性基因的干扰，提高黄河鲤养殖产业的经济效益。
23.本发明采用了较少的试剂，整个方法方便快捷，容易操作，可以在较短时间内，就能快速准确地进行鉴定。这样有利于科研部门或者实际生产部门快速鉴定所取样品，准确地挑取不含红色突变等位基因的亲鱼进行繁育，有效地避免产生不被市场认可的红色的子代鱼苗。
24.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
25.图1是pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
26.图1中1为2k dnamarker；2
‑
4为红色突变的黄河鲤；5
‑
10为体色正常的黄河鲤，其中5
‑
8为携带红色突变等位基因的黄河鲤，用其作为父母本繁育后产生的子代中出现一定比例的红色鱼苗；
27.图2是83个样本的凝胶电泳检测图。
具体实施方式
28.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
29.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
30.实施例1
31.本发明提供采用pcr法鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的引物对，所述引物对由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物序列为：ttagatgactgatcgcttccta，下游引物序列为：tgtatgtatgccgtacctgat。
32.快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法，包括：
33.1)提取鳍条样本dna；
34.2)pcr扩增；
35.使用特异性引物对步骤1)所提取的dna进行pcr扩增，所用引物序列为：
36.上游引物序列ttagatgactgatcgcttccta
37.下游引物序列tgtatgtatgccgtacctgat；
38.3)对步骤2)的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
39.4)根据凝胶电泳图谱中的条带情况对黄河鲤进行鉴定；
40.凝胶电泳图谱中512bp和468bp处各显示一条带的为携带红色突变等位基因的黄河鲤。如图1所示，该基因位点在携带红色突变等位基因的黄河鲤中为一上一下两条带，其中，上带512bp，下带468bp，而在其它正常体色黄河鲤中只有上面一条单一条带，在红色突变的黄河鲤中只有下面一条单一条带。
41.所述的快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法中，pcr体系为：2
×
es taq mastermix 20微升，样本dna2微升，浓度为10μm的上游引物1微升，浓度为10μm的下游引物1微升，无菌水16微升；
42.pcr过程为：94℃4min变性；94℃30s预热，60℃30s偶联，72℃45s延伸，30个循环；72℃10min延伸；4℃保存。
43.所述的快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的方法中，所述步骤3)中将pcr扩增产物用质量体积比为2％(0.02g/ml)的琼脂糖凝胶(2克琼脂糖溶于100毫升缓冲液配制而成)在80v电压下电泳1小时。
44.用于快速鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤的pcr扩增试剂，所述扩增试剂包含上述引物对。
45.上述引物对在鉴定携带红色突变等位基因的黄河鲤中的应用。
46.实验1
47.随机选取83条黄河鲤亲鱼来进行试验，其中包括红色黄河鲤37条，携带红色突变等位基因的黄河鲤25条(经过验证，用作父母本繁育后产生了一定比例的红色子代鱼苗)，其它正常体色黄河鲤21条。
48.根据实施例1的方法，剪下少量鳍条，提取dna，经pcr扩增和电泳检测的结果为：红色检出37条，携带红色突变等位基因的黄河鲤25条，其它正常体色黄河鲤21条。检测准确率为83/83
×
100％＝100％。详细信息，请见表1，电泳表型中双带表示一上一下两条带，单一(上带)表示只有上面一条单一条带，单一(下带)表示只有下面一条单一条带。电泳图见图2。
49.表1样本信息表
50.51.[0052][0053]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例和图例。