基于纳米孔技术的DNA-纳米颗粒复合材料及其制备方法与应用

基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及纳米孔检测领域，具体地说，涉及一种基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.纳米孔技术是一种用于检测和表征溶液中单个分子的通用技术，其区别于传统检测手段的特点为无需标记、检测通量高、灵敏度高、操作简单等特点，这些特点决定了纳米孔技术在分子检测方面具有较为广泛的应用前景。纳米孔主要分为生物纳米孔和固态纳米孔两类，对于生物纳米孔而言，最常用的是生物蛋白纳米孔，例如α-溶血素(英文简称α-hl)。早期生物纳米孔主要用来检测核酸，但是生物蛋白纳米孔的空间和时间分辨率比较低且自身在稳定性、持久性等方面存在不足，固态纳米孔应运而生。固态纳米孔属于人造纳米孔，它的尺寸可控，有更好的稳定性，更加灵敏且可重复利用，是检测蛋白分子的理想工具。
3.纳米孔单分子传感器相比其他传统单分子检测技术而言具有低成本高通量的优势。在固态纳米孔装置中，当一个带电生物分子在外加电场力的作用下电泳穿过纳米孔时，由于其物理占位作用及其与纳米孔壁间的强相互作用，离子电流会产生瞬间变化，表现为短时的尖峰，每个尖峰对应一个易位事件，通过对电流变化以及易位时间的分析可以获取待测分子的带电特性，形状大小以及运动行为等特征。因此，纳米孔被广泛应用于一些单分子的检测中，如核酸分子，蛋白质，核酸与蛋白的结合物等，甚至用于单个dna碱基以及蛋白质氨基酸的识别。
4.纳米科技是21世纪前沿科学技术的代表领域之一，已经成为世界各国重要的科技发展战略。由于纳米颗粒处于微观和宏观物质之间的区域，纳米颗粒具有一些特异的理化性质，如光学、化学、点学。纳米金颗粒(aunps)，是直径在1-100纳米的金属颗粒。纳米金颗粒的表面稳定性高且表面积大，具有较强的催化作用，重要的是可与多种生物分子(dna、rna、蛋白质)作用而不影响其生物活性。金纳米颗粒的表面根据制作方法的不同可以带正电荷或者负电荷，甚至不带电荷。dna由于本身的磷酸骨架，在中性环境中都带有负电。将dna做成载体，携载金颗粒过纳米孔有增强或者抑制的作用，这些特点实现了与纳米孔技术的结合，而且纳米金颗粒作为纳米实验的一个重要的工具，不仅能在其金表面与核酸结合，而且可以通过适配体与蛋白结合，从而增加了实验的多样性。可通过实验设计来识别特定的蛋白，甚至可以做成癌症治疗的靶向药物。
5.癌症是全球发病和死亡的主要原因。预防是治愈疾病最佳的良药，尤其是对于癌症来说，如果能对癌症进行提前的预测并进行干预，无疑能达到最好的结果。由于癌症的复杂性，联合采用多种技术可以有效提高诊断的准确性。总体而言，核酸检测仍然是诊断的金标准。利用纳米孔技术的特性，可为疾病分子检测方面提供新途径。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料及其制备方法与应用。
7.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料，所述复合材料是将由seq id no:1-4所示的四条核酸分子退火形成的四面体dna与带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链进行杂交得到的，所述dna单链的核苷酸序列如seq id no:5所示。
8.优选地，seq id no:1-4所示的核酸分子按等摩尔比混合退火。
9.所述纳米颗粒为纳米金颗粒，粒径为1-100nm(优选5nm)。
10.第二方面，本发明提供所述复合材料的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)四面体dna的制备：将seq id no:1-4所示的四条核酸分子按等摩尔比混合于1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，94℃保持4分钟，然后在5分钟内匀速降温至25℃，退火形成四面体dna；
12.其中，1
×
tae/mg
2+
缓冲液的组成如下：40mm tris，20mm乙酸，2mm edta和12.5mm乙酸镁，ph8.0；
13.(2)巯基修饰的dna单链的制备：将seq id no:5所示的dna单链进行巯基修饰，得到巯基修饰的dna单链(5
′‑
atcagactgatgttgattt-sh-3
′
)；
14.(3)带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链的制备：将上述巯基修饰的dna单链与纳米颗粒混合，室温反应过夜(室温一般为25℃左右)，加入保护剂寡聚乙二醇(oeg，添加oeg的终浓度为0.0025-0.005mg/ul，分子量为915.11g/mol)，得到带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链；
15.(4)dna-纳米颗粒复合材料的制备：将四面体dna和带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链于室温进行杂交。
16.第三方面，本发明提供所述复合材料的以下任一应用：
17.1)用于制备癌症检测试剂和试剂盒；
18.2)用于制备癌症治疗药物；
19.3)用于制备药物递送载体。
20.本发明中，所述癌症是指高表达特异性分子mir-21的癌症，包括但不限于乳腺癌、宫颈癌。
21.第四方面，本发明提供一种基于纳米孔技术的癌症检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的复合材料，纳米孔检测装置和缓冲液。
22.优选地，所述纳米孔检测装置为固态氮化硅纳米孔板，厚度30nm，孔径30nm。
23.所述缓冲液为0.5m氯化钾溶液。
24.第五方面，本发明提供一种癌症治疗药物，所述药物是在所述复合材料的纳米颗粒表面修饰具有治疗效应的蛋白得到的。
25.例如，蛋白与纳米颗粒之间可通过适配体链接。在适配体的一端进行巯基修饰，在室温下孵育过夜可将具有治疗效应的蛋白长在纳米颗粒上。
26.第六方面，本发明提供一种基于纳米孔技术和纳米颗粒的疾病检测方法，所述方法包括：将来自癌症患者的样本与本发明基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料相接
触，目标疾病分子的特异性核酸能够参与链置换反应将四面体dna框架上的纳米颗粒置换下来。在纳米孔过孔实验时，添加疾病分子将纳米颗粒置换下来的样本与原样本形成显著差别，起到区分样本的作用，进而实现对癌症疾病分子的检测。
27.第七方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向癌症患者体内给予本发明的癌症治疗药物(即在所述复合材料的纳米颗粒表面修饰有治疗效应蛋白)，药物进入体内后迅速抵达病灶，与癌症疾病分子匹配后释放出纳米颗粒-药物蛋白结合体，起到治疗癌症的作用。
28.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
29.本发明基于纳米孔技术，首次提出一种新型的dna携带纳米颗粒(如aunps)过孔的检测机制，并开发出基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料，其中核酸载体是由四条dna单链核酸分子通过互补配对形成的正四面体dna结构，金颗粒结合在四面体外部。加入待测疾病分子后，与四面体dna-金颗粒载体正确匹配的疾病分子，能够将四面体外的金颗粒释放。通过琼脂糖凝胶电泳检测和纳米孔装置检测，结果表明该疾病分子的检测具有很强的特异性，只有匹配的疾病分子能释放金颗粒。进一步地，在金颗粒的表面结合了药物蛋白的适配体，使得金颗粒能够与药物蛋白结合。再结合匹配疾病分子能够释放金颗粒的机制，从而达到匹配的疾病分子能释放金颗粒-药物蛋白结合体的效果，在疾病检测与疾病治疗等医学领域具有广泛的应用前景。
附图说明
30.图1为本发明较佳实施例中纳米孔装置示意图。
31.图2为本发明较佳实施例中基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料的结构示意图。
32.图3为本发明较佳实施例中金颗粒的释放过程。
33.图4为本发明较佳实施例中过孔信号轨迹。其中，(a)为dna-纳米颗粒复合结构通过纳米孔的电流信号图。图中每个下降代表一个dna-纳米颗粒复合结构过孔。(b)为在加入疾病检测分子后将复合结构的纳米颗粒置换下来，只留下dna框架结构通过纳米孔的电流信号图。此时信号较少，电流下降幅度也较低。
34.图5为本发明较佳实施例中四面体-金颗粒-药物蛋白结合体的结构示意图。
35.图6为本发明较佳实施例中金颗粒-药物蛋白的释放过程。
36.图7为本发明较佳实施例中金颗粒-药物蛋白无法释放。
37.图8为本发明较佳实施例中四面体-金颗粒载体过孔数据。其中，(a)为dna-纳米颗粒复合结构通过纳米孔时，其过孔信号的幅值柱状分析图，图中黑曲线为高斯拟合图，拟合出其平均电流幅值为577.5
±
259.504pa。(b)为dna-纳米颗粒复合结构通过纳米孔时，其过孔信号的易位时间柱状分析图，图中黑曲线为高斯拟合图，拟合出其平均易位时间为0.110
±
0.0404ms。
38.图9为本发明较佳实施例中四面体过孔数据。其中，(a)为dna框架结构通过纳米孔时，其过孔信号的幅值柱状分析图，图中黑曲线为高斯拟合图，拟合出其平均电流幅值为455.2
±
105.886pa。(b)为dna框架结构通过纳米孔时，其过孔信号的易位时间柱状分析图，图中黑曲线为高斯拟合图，拟合出其平均易位时间为0.108
±
0.0437ms。
具体实施方式
39.本发明利用纳米孔技术无需标记、检测通量高、灵敏度高、操作简单等特点，设计一种四面体dna框架，其中在四面体框架一条边上特异性结合了一个纳米颗粒，目标疾病分子的特异性核酸能够参与链置换反应将四面体框架上的纳米颗粒置换下来，从而能够高效快速地检测癌症疾病分子。
40.本发明采用如下技术方案：
41.1、设计dna四面体框架。四面体结构由四条dna单链通过碱基互补配对结合而成。
42.2、金颗粒的制备。选择与四面体载体适合的金颗粒，将金颗粒用一定方法(加入oeg保护剂)保护防止金颗粒的聚沉。
43.3、将四面体框架与金颗粒混合，金颗粒固定在四面体一侧。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)观察结构反映四面体dna的生成情况，通过琼脂糖凝胶电泳观察金颗粒结合情况。
44.4、检测四面体框架结合金颗粒和加入待检测疾病分子后金颗粒脱离载体的两种样本，比较过孔产生的电信号的差异，确定疾病分子成功将金颗粒置换下来，从而达到疾病检测的目的。
45.5、将制备好的金颗粒通过适配体与具有治疗效应的蛋白结合。然后再将结合好蛋白的金颗粒与四面体载体结合。检测载体结合有蛋白修饰的金颗粒，检测加入疾病分子后金颗粒联同药物蛋白一起被释放，此时只有核酸四面体载体，比较过孔产生的信号，确定疾病分子被检测到以及药物蛋白的释放。
46.通过上述方法，可以实现用固态纳米孔检测相关疾病分子，以及相关的治疗蛋白的释放以达到治疗目的。
47.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料的制备
48.1、实验材料
49.(1)所有dna链都是通过nupack软件设计并模拟。委托上海生工进行合成。
50.(2)实验所用各类蛋白购自索莱宝公司。
51.(3)dna链均使用实验用水溶解，并用nanodrop 2000仪器测定浓度。
52.(4)纳米孔使用固态氮化硅纳米孔，厚度30nm，使用离子束电镜穿孔，穿孔直径为30nm。
53.(5)dna四面体制备在1
×
tae/mg
2+
缓冲液(40mm tris，20mm乙酸，2mm edta和12.5mm乙酸镁，ph8.0)中进行。
54.(6)纳米孔室腔缓冲液为0.5m氯化钾(kcl)溶液(称取11.182g氯化钾，在37℃下溶解于50ml水)。
55.(7)聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)实验所用母液为45％page溶液(称取217g丙烯酰胺和8g亚甲双丙烯酰胺，在37℃下溶解，加入去离子水定容至500ml)。
56.聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)实验检测：配制12％page胶(12ml蒸馏水，6ml45％page溶液，150μl 10％过硫酸铵(aps)溶液，15μl四甲基乙二胺(temed)溶液)。
57.琼脂糖凝胶电泳实验：配制1％的琼脂糖胶(1.5g琼脂糖，7.5ml 10
×
tbe，
15ml110mm氯化镁，127.5ml蒸馏水)。
58.纳米孔实验检测：实验仪器：纳米孔装置购自molecular devices，商品型号axon instruments cv-7b。膜片钳放大器购自molecular devices，商品型号axopatch 700b patch clamp amplifier。
59.2、实验方法
60.(1)dna四面体框架的形成
61.四条dna单链(seq id no:1-4)以1:1:1:1的比例(摩尔比)混合进行退火，94℃保持4分钟，然后在5分钟之内匀速降温至室温(25℃)，形成四面体结构。在page凝胶中观察实验结果。
62.(2)巯基修饰的dna单链的制备
63.将seq id no:5所示的dna单链进行巯基修饰，得到巯基修饰的dna单链。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
64.(3)带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链的制备
65.将上述巯基修饰的dna单链与纳米颗粒混合，室温(一般为25℃左右)下孵育过夜，加入保护剂oeg(添加oeg的终浓度为0.0025-0.005mg/ul，分子量为915.11g/mol)，得到带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链。
66.(4)dna-纳米颗粒复合材料的制备
67.将dna四面体框架和带有巯基修饰的纳米颗粒的dna单链于室温(25℃)进行杂交。
68.为了研究金颗粒是否能与四面体稳定结合，使用琼脂糖凝胶电泳加以证明。
69.dna四面体框架通过page凝胶切胶回收，纳米金颗粒与巯基化的dna杂交，形成双聚体结构，室温下放置反应4小时。然后加入oeg将金颗粒表面保护起来，防止聚沉。
70.将制备好的带有巯基链的金颗粒与回收好的四面体载体室温下放置反应过夜。最后使用琼脂糖凝胶来回收四面体与金颗粒的杂交结构。从琼脂糖凝胶电泳上可以清晰的观察到，与四面体结合的金颗粒与没有结合四面体的金颗粒会有不同的条带，从而证明四面体与金颗粒成功结合，即为基于纳米孔技术的dna-纳米颗粒复合材料。
71.为了保证金颗粒可以高效地结合到四面体上，在金颗粒的表面修饰了3-5条巯基链。dna四面体是由四条dna单链通过碱基互补配对结合而成(tet-s1,tet-s2,tet-s3,tet-s4，序列见seq id no:1-4)，其中一条单链的末端包含有和金颗粒表面巯基链互补的捕捉链。在形成的四面体中，这个捕捉链的位置位于一条边上，金颗粒空间直径5nm左右，可以结合。
72.实施例2使用纳米孔装置检测不同样本
73.使用同一尺寸大小的纳米孔进行两个样本的检测，纳米孔装置的示意图见图1。一个样本是四面体-金颗粒结合体(图2)，另一个样本是四面体-金颗粒结合体加入疾病分子后的混合样本(图3)，首先制备的两个样本保证浓度相同，都是2nm。纳米孔装置先用水清洗干净，再用乙醇排出装置内的气泡，最后用0.5m氯化钾缓冲液润洗，然后将样本加入纳米孔装置的顺势端室腔，在外加电压的作用下，样本结构会从顺势端穿过纳米孔进入反势端，通过膜片钳放大器能够清晰地看到信号的轨迹(图4)，根据信号轨迹容易分析出结构过孔的过程，将没有结构过孔时的电流水平称为level0，在样本(dna-纳米颗粒复合材料或dna四面体结构)过孔开始就会产生电流下降，此时的电流水平称为level1。当四面体-金颗粒结
构过孔时，在level1的水平上还会再产生一个额外的电流下降尖峰，此时的电流水平称为level2，在四面体通过纳米孔后，电流水平恢复到leve1，直到结构全部通过纳米孔，电流恢复到level0。两个样本的轨迹用matlab程序从阻塞电流和过孔时间两个方面进行分析，从分析结果可知，携带有金颗粒的结构过孔时的阻塞电流较大，也就是带有金颗粒的level2水平比不带金颗粒的level2水平低。这个特征可以明显区分过孔的结构是否携带有金颗粒，进而可以证明疾病分子成功将金颗粒置换下来。
74.检测结果如图4所示，检测了1m kcl盐溶液中的纳米孔检测结果。其中(a)为四面体-金颗粒结合体通过纳米孔的电流信号图；(b)为四面体-金颗粒结合体在添加疾病分子后将金颗粒置换下来后，单独的四面体通过纳米孔的电流信号图。
75.检测结果的数据处理如图8、图9所示，其中图8检测了1m kcl盐溶液中添加四面体-金颗粒结合体结构的纳米孔检测结果。其中(a)为dna四面体-金颗粒结合体通过纳米孔时，对其过孔信号的幅值柱状分析图，其中红曲线为高斯拟合图，拟合出其平均电流幅值为577.5
±
259.504pa；(b)为对其过孔信号的易位时间的柱状分析图，其中红曲线为高斯拟合图，拟合出其平均易位时间为0.110
±
0.0404ms。另外图9检测了四面体-金颗粒结合体结构在添加疾病分子后，疾病分子将金颗粒置换下来后，dna四面体结构单独通过纳米孔的检测结果。其中(a)为dna四面体通过纳米孔时，对其过孔信号的幅值柱状分析图，其中红曲线为高斯拟合图，拟合出其平均电流幅值为455.2
±
105.886pa；(b)为对其过孔信号的易位时间的柱状分析图，其中红曲线为高斯拟合图，拟合出其平均易位时间为0.108
±
0.0437ms。由检测结果可知dna四面体-金颗粒结合体引起的过孔幅值远远超过了单独四面体通过纳米孔所引起的幅值变化，这是因为金颗粒所导致的，进而证明疾病分子检测机制的可靠性。
76.四面体-金颗粒携载药物蛋白过孔：
77.上述实验已经证明四面体-金颗粒结合体能够通过纳米孔产生电流信号，也能证明加入疾病分子之后，与四面体结合的金颗粒成功释放。本实验中在金颗粒的表面结合药物蛋白适配体，加入药物蛋白后可以结合在金颗粒的表面。
78.使用同一纳米孔进行两个样本的检测，一个样本是四面体-金颗粒结合体(图2)，另一个样本是四面体-金颗粒-药物蛋白结合体(图5)，使用膜片钳放大器来记录过孔信号。两个样本的轨迹用matlab程序从阻塞电流和过孔时间两个方面进行分析，从分析结果可知，四面体-金颗粒-药物蛋白结合体的阻塞电流大于四面体-金颗粒结合体。这可以证明药物蛋白能够成功结合在金颗粒的表面。
79.四面体-金颗粒携载体携载不同药物蛋白过孔：
80.为了证明四面体-金颗粒结构载体有很好的适用性，我们在金颗粒表面更换了不同的蛋白适配体，重复了以上研究过程，都有相似的结果。如此证明四面体-金颗粒载体携带蛋白分子过孔来研究蛋白过孔行为的方法是可靠有效的。
81.四面体-金颗粒-药物蛋白结合体的释放：
82.只有与药物蛋白一致的疾病分子才能在加入四面体-金颗粒-药物蛋白结合体后才能释放金颗粒-药物蛋白结合体。也就是说，疾病分子有很强的特异性。将不同的疾病分子加入到四面体-金颗粒-药物蛋白结合体中，只有匹配的疾病分子能在过孔实验中看到不同的电流信号，不匹配的疾病分子过孔信号没有变化。
83.使用同一纳米孔进行两个样本的检测，一个样本是四面体-金颗粒-药物蛋白结合
体加入匹配的疾病分子(图6)，另一个样本是四面体-金颗粒-药物蛋白结合体加入不匹配的疾病分子(图7)，两个样本的轨迹用matlab程序从阻塞电流和过孔时间两个方面进行分析，从分析结果可知，只有加入相匹配的疾病分子才能观察到信号的不同(此时的金颗粒-药物蛋白已经释放)。
84.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。