针对AFP的高亲和力TCR的制作方法

本发明涉及生物，更具体地涉及能够识别衍生自afp蛋白多肽的t细胞受体(t cell receptor,tcr)。本发明还涉及所述受体的制备和用途。

背景技术：

1、仅仅有两种类型的分子能够以特异性的方式识别抗原。其中一种是免疫球蛋白或抗体；另一种是t细胞受体(tcr)，它是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。免疫系统的tcr总谱的组成是在胸腺中通过v(d)j重组，然后进行阳性和阴性选择而产生的。在外周环境中，tcr介导了t细胞对主组织相容性复合体-肽复合物(pmhc)的特异性识别，因此其对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的。

2、tcr是呈递在主组织相容性复合体(mhc)上的特异性抗原肽的唯一受体，这种外源肽或内源肽可能会是细胞出现异常的唯一迹象。在免疫系统中，通过抗原特异性的tcr与pmhc复合物的结合引发t细胞与抗原呈递细胞(apc)直接的物理接触，然后t细胞及apc两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的t细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

3、与tcr相对应的mhc i类和ii类分子配体也是免疫球蛋白超家族的蛋白质但对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的mhc，从而能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的apc细胞表面。人类的mhc通常称为hla基因或hla复合体。

4、afp(αfetoprotein)也称α胎蛋白，是胚胎发育过程中表达的一种蛋白，是胚胎血清的主要成分。在发育过程中，afp在卵黄囊及肝脏中有比较高的表达水平，随后被抑制。在肝细胞癌中，afp的表达被激活(butterfield et al.jimmunol.,2001,apr 15；166(8):5300-8)。afp在细胞内生成后被降解成小分子多肽，并与mhc(主组织相容性复合体)分子结合形成复合物，被呈递到细胞表面。tsselmaitr(seq id no:9)是衍生自afp抗原的短肽，是afp相关疾病治疗的一种靶标。

5、因此，tsselmaitr-hla a1101复合物提供了一种tcr可靶向肿瘤细胞的标记。能够结合tsselmaitr-hla a1101复合物的tcr对肿瘤的治疗具有很高的应用价值。例如，能够靶向该肿瘤细胞标记的tcr可用于将细胞毒性剂或免疫刺激剂递送到靶细胞，或被转化入t细胞，使表达该tcr的t细胞能够破坏肿瘤细胞，以便在被称为过继免疫治疗的治疗过程中给予患者。对于前一目的，理想的tcr是具有较高的亲和力的，从而使该tcr能够长期驻留在所靶向的细胞上面。对于后一目的，则优选使用中等亲和力的tcr。因此，本领域技术人员致力于开发可用于满足不同目的的靶向肿瘤细胞标记的tcr。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种对tsselmaitr-hla a1101复合物具有较高亲和力的tcr。

2、本发明的再一目的是提供一种上述类型tcr的制备方法及上述类型tcr的用途。

3、本发明的第一方面，提供了一种包含了α链可变域和β链可变域的t细胞受体(tcr)，其具有结合tsselmaitr-hla a1101复合物的活性，并且所述tcrα链可变域的氨基酸序列与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性和所述tcrβ链可变域的氨基酸序列与seq id no:2所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性。

4、在一优选例中，所述tcrα链可变域的氨基酸序列和所述tcrβ链可变域的氨基酸序列不同时为野生型tcrα链可变域的氨基酸序列和野生型tcrβ链可变域的氨基酸序列。

5、在进一步的优选例中，所述tcrα链可变域的氨基酸序列不是seq id no:1所示的氨基酸序列，和/或所述tcrβ链可变域的氨基酸序列不是seq id no:2所示的氨基酸序列。

6、在另一优选例中，所述tcr的α链可变域包含与seq id no:1所示的序列有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列，或相对于seq id no:1所示的序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基插入、缺失、替换或其组合。

7、在另一优选例中，所述tcr的β链可变域为与seq id no:2所示的序列有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性的氨基酸序列，或相对于seq id no:2所示的序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基插入、缺失、替换或其组合。

8、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的氨基酸序列与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少95％的序列同源性。

9、在另一优选例中，所述tcrα链可变域中cdr1α为：drgsqs，和cdr2α为iysngd。

10、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的cdr3α选自avkvggsshlt和avkvggnshlt。

11、在另一优选例中，所述tcrβ链可变域的3个cdr为：cdr1β：sehnr；cdr2β：fqneaq；和cdr3β：asspvgeqy。

12、在另一优选例中，所述tcrβ链可变域的氨基酸序列为seq id no:2。

13、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的氨基酸突变个数为2-3个，优选地为2个。

14、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的氨基酸突变位点为cdr3α的第7位和第9位。

15、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的3个cdr区(互补决定区)的基准序列如下，

16、cdr1α：drgsqs

17、cdr2α：iysngd

18、cdr3α：avkvggystlt，并且cdr3α含有至少一个下列突变：

19、 突变前的残基 突变后的残基 cdr3α的第7位y s或n或d cdr3α的第9位t h或w

20、在另一优选例中，所述cdr3α中氨基酸突变包含：

21、 突变前的残基 突变后的残基 cdr3α的第9位t h

22、在另一优选例中，所述tcr与tsselmaitr-hla a1101复合物的亲和力是野生型tcr的至少4倍。

23、在另一优选例中，所述tcr在seq id no：1所示的α链可变域中发生突变，所述突变选自v93i、y96s/n/d、s97t和t98h/w中的一组或几组，其中氨基酸残基编号采用seq id no:1所示的编号。

24、在另一优选例中，所述tcr具有选自下组的cdr:

25、

26、在另一优选例中，所述tcr是可溶的。

27、在另一优选例中，所述tcr为αβ异质二聚tcr，包含α链trac恒定区序列和β链trbc1或trbc2恒定区序列。

28、在另一优选例中，所述tcr包含(ⅰ)tcrα链可变域和除跨膜结构域以外的全部或部分tcrα链恒定区；和(ⅱ)tcrβ链可变域和除跨膜结构域以外的全部或部分tcrβ链恒定区。

29、在另一优选例中，所述tcr的α链恒定区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。

30、在另一优选例中，在所述tcrα与β链的恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

31、trac*01外显子1的thr48和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser57；

32、trac*01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser77；

33、trac*01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser17；

34、trac*01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的asp59；

35、trac*01外显子1的ser15和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu15；

36、trac*01外显子1的arg53和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser54；

37、trac*01外显子1的pro89和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ala19；

38、和trac*01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu20。

39、在另一优选例中，所述tcr的α链可变域氨基酸序列为seq id no:13-19之一；和/或所述tcr的β链可变域氨基酸序列为seq id no:2。

40、在另一优选例中，所述tcr选自下组：

41、

42、在另一优选例中，所述tcr是人源的。

43、在另一优选例中，所述tcr是分离与纯化的。

44、在另一优选例中，所述tcr为单链tcr。

45、在另一优选例中，所述tcr是由α链可变域和β链可变域组成的单链tcr，所述α链可变域和β链可变域由一柔性短肽序列(linker)连接。

46、在另一优选例中，所述tcr包含α链恒定区与β链恒定区，所述α链恒定区为鼠的恒定区和/或所述β链恒定区为鼠的恒定区。

47、在另一优选例中，所述tcr包含α链恒定区与β链恒定区，所述α链恒定区为鼠源的恒定区和/或所述β链恒定区为鼠源的恒定区。

48、在另一优选例中，所述tcr的α链和/或β链的c-或n-末端结合有偶联物，优选地，所述偶联物为可检测标记物、治疗剂、pk修饰部分或任何这些物质的组合。

49、在另一优选例中，与所述tcr结合的治疗剂为连接于所述tcr的α或β链的c-或n-末端的抗-cd3抗体。

50、本发明的第二方面，提供了一种多价tcr复合物，其包含至少两个tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为上述权利要求中任一项所述的tcr。

51、本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的tcr分子或者本发明第二方面所述的多价tcr复合物的核酸序列或其互补序列。

52、本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的所述的核酸分子。

53、本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。

54、本发明的第六方面，提供了一种分离的细胞，所述细胞表达本发明第一方面所述的tcr，优选地，所述分离的细胞t细胞、nk细胞、nkt细胞，最优选地，所述分离的细胞是t细胞。

55、本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的tcr、或本发明第二方面所述的tcr复合物、或本发明第六方面所述的细胞。

56、本发明的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的tcr、或本发明第二方面所述的tcr复合物、或本发明第六方面所述的细胞、或本发明第七方面所述的药物组合物,优选地，所述疾病为afp阳性肿瘤，更优选地，所述肿瘤为肝癌。

57、本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的tcr、或本发明第二方面所述的tcr复合物、或本发明第六方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物，优选地，所述疾病为afp阳性肿瘤，更优选地，所述肿瘤为肝癌。

58、本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的t细胞受体的方法，包括步骤：

59、(i)培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的t细胞受体；

60、(ii)分离或纯化出所述的t细胞受体。

61、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。