1.本发明涉及固定化氧化还原酶的方法，属于酶固定化领域。
背景技术：
2.氧化还原酶是一类能催化两分子间发生氧化还原作用的酶的总称，包括多种重要的酶类。其中，氨基酸脱氢酶(aadh)可催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸还原胺化反应。对于非天然底物的还原胺化反应，选择底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(eopb)在含铵盐体系中(提供nh
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受体)进行还原胺化高选择性生成l-高苯丙氨酸(lhpa)。利用aadh可合成非天然氨基酸l-高苯丙氨酸(lhpa)，以便更广泛地应用在药物、新型生物材料和化妆品等领域。
3.由于游离的脱氢酶稳定性差，采用固定化的方法可进行改善。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用的载体材料的性质和固定化方法。目前的氨基酸脱氢酶等氧化还原酶的固定技术，还存在固定化酶稳定性差，重复利用活性低等问题，更重要的是固定化酶应用在连续性反应器中比较少。因此，还有必要对固定化方法和在连续性反应器中的应用进行进一步研究。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了羊毛固定化酶的制备方法及羊毛固定化酶柱反应器。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
6.一种羊毛固定化酶的制备方法，采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺对羊毛进行表面处理，处理温度为25～65℃，反应时间不超过3h，得到表面修饰后的羊毛；将表面修饰后的羊毛浸入到氧化还原酶溶液中充分混匀结合，所述氧化还原酶的终浓度为0.1～100mg/ml，0～50℃混匀后，加入化学交联剂使其体积分数为2～3％进行交联共价或者加入金属离子并使其终浓度为0.8～40mm进行配位，所述的化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或戊二醛(ga)中的至少一种，所述金属离子包括mg
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、zn
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、ni
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、mn
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或cu
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中的至少一种，进行交联或者配位10～100min，即得羊毛固定化氧化还原酶。
7.进一步地，氧化还原酶均可采用此方法，所述氧化还原酶例如包括氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶、苹果酸脱氢酶等脱氢酶。
8.优选地，所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，带有his-tag标签。胺脱氢酶序列如seq id no.2所示，带有his-tag标签。苹果酸脱氢酶序列如seq id no.3所示，带有his-tag标签。
9.进一步地，所述表面修饰后的羊毛采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺进行表面处理制备得到，即将羊毛浸入在尿素、硫化钠和十二烷基硫酸钠的混合溶液中进行表面处理；其中，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2。
10.优选地，所述羊毛的表面处理时间不能过长，以保留羊毛纤维骨架用于固定化。进一步优选地，所述表面处理的反应时间不超过2h。更进一步优选地，所述表面处理的反应时间为0.5～1.5h，羊毛骨架保留最完整且活性基团暴露最多使固定化酶负载量最高。
11.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
12.一种羊毛固定化酶柱反应器，所述羊毛固定化酶柱反应器内填充有表面修饰后的羊毛，所述表面修饰后的羊毛上交联固定或配位固定有所述酶。
13.优选地，所述羊毛固定化酶柱反应器的长径比为1:1～10:1。
14.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
15.一种羊毛固定化酶柱反应器的制备方法，采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺对羊毛进行表面处理，得到表面修饰后的羊毛；将表面修饰后的羊毛填充到玻璃层析柱中，用缓冲液循环平衡后，排干缓冲液，接入带his-tag标签的纯酶溶液，0～50℃循环固定化1～3h，羊毛与酶结合完成后接入含有化学交联剂的缓冲液进行交联或者接入含有金属离子的缓冲液进行配位，交联或者配位结束后用缓冲液进行洗柱，即得羊毛固定化酶柱反应器。
16.优选地，采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺对羊毛进行表面处理，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2，处理温度为25～65℃，反应时间不超过3h。
17.优选地，所述酶例如为氧化还原酶，所述氧化还原酶包括氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶或苹果酸脱氢酶中的至少一种。所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列例如seq id no.1所示；所述胺脱氢酶的氨基酸序列例如seq id no.2所示；所述苹果酸脱氢酶的氨基酸序列例如seq id no.3所示。
18.优选地，所述带his-tag标签的纯酶溶液中酶的终浓度为0.1～100mg/ml，含有化学交联剂的缓冲液中化学交联剂的体积分数为2～3％，含有金属离子的缓冲液中金属离子的浓度为0.8～40mm，进行交联或者配位10～100min。
19.优选地，所述化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或戊二醛(ga)中的至少一种。
20.优选地，所述金属离子包括mg
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、zn
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、ni
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、mn
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或cu
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中的至少一种。
21.优选地，所述缓冲液例如为pbs缓冲液。
22.以如seq id no.1所示的氨基酸脱氢酶为例，利用表面修饰后的羊毛作为固定载体固定化氨基酸脱氢酶，并用化学交联剂进行共价交联或金属离子进行共价或者配位结合，可以提高氨基酸脱氢酶的温度稳定性与重复使用次数。利用上述方法制备得到的固定化氨基酸脱氢酶的最适ph为9.5，最适温度为50～70℃。
23.柱反应器(column reactor，cr)固定化酶不仅可提高游离酶的稳定性，还可实现其重复使用，从而降低使用成本。然而，底物与产物在传统的固定化酶反应器中的扩散局限性往往严重阻碍了固定化酶分子与底物的接触，从而引起水解效率的降低。
24.表面修饰后的羊毛(surface modified wool，smw)中含有大量的角蛋白，它的大分子链中含有大量的肽键结构，这是蛋白质类物质的大分子链结构中所具有的基本骨架结构。除此以外，大分子链表面还有大量的氨基、羧基和巯基等官能团。羊毛角蛋白由无规卷曲、α－螺旋和β－折叠平行多肽构象一起组成的极致密的结构。表面修饰后的羊毛保留了基本骨架，暴露出更多的活性基团，展现出了较好的生物性能。
25.本发明经研究发现，表面修饰后的羊毛和酶相互结合后加入化学交联剂或者金属离子等可以形成稳定的共价键或配位键，具有良好的生物相容性，有利于酶固定化。利用表面修饰后的羊毛作为填料能够用于制备固定化酶柱反应器，这是此前通过羊毛角蛋白固定化酶等固定方式都无法做到的。且羊毛作为填料具有丰富的孔隙，利用表面修饰后的羊毛制备的固定化酶柱反应器往往具有高孔隙率和低扩散限制的优点，可避免因扩散及逆流问题所导致的底物与酶无法接触。理论上，相对更大的孔径可保证其在实际应用中的高流速与高处理量。羊毛在表面修饰后仍具有机械强度较好的骨架能很好的维系柱反应器的稳定性，该反应器主要将非天然氨基酸转化为药物中间体，所以采用生物相容性较好的羊毛作为填料更有利于底物的结合与产物的分离。且羊毛价格低廉，在填料资源用量大、浪费十分严重的情况下，使用羊毛作为反应器填充物是十分必要的，有利于降低研发和生产成本。
26.在本发明的一个具体的实施例中，所述方法包括以下步骤：
27.1)粗酶液制备：将可表达带his-tag标签的氧化还原酶的重组表达菌株接种到含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂iptg；培养所得菌液，离心获取细胞，配制成细胞悬液；超声破碎并离心，收集上清液即为含有带his-tag标签的氧化还原酶的粗酶液；
28.具体地，其中的氧化还原酶例如为氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶或苹果酸脱氢酶。构建可表达带his-tag标签的氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶和苹果酸脱氢酶的重组表达菌株的方法：氨基酸脱氢酶的基因序列如seq id no.1所示；胺脱氢酶基因序列如seq id no.2所示；苹果酸脱氢酶基因序列如seq id no.3所示；用ndei和xhol分别双酶切所述氨基酸脱氢酶基因、胺脱氢酶及苹果酸脱氢酶和pet28a质粒，连接转化，得到pet28a-aadh质粒、pet28a-amdh质粒和pet28a-mdh质粒；将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his-tag标签的氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶和苹果酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
29.将该可表达带his-tag标签的氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶和苹果酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a接种到含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂iptg。所述的接种量为1～3％，所述的lb培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/l，酵母浸膏1.0～10.0g/l，nacl 0.0～15.0g/l，调节ph 7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150μg/ml；所述培养条件为36～38℃，150～250rpm培养1.5～6h后加入诱导剂iptg，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养2～12h。培养所得菌液，在冷冻离心机中离心(优选为4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph 7～7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次。用磷酸缓冲液(ph 6.5～8.0)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
30.将制备的细胞悬液置于冰浴中，超声细胞破碎仪探头置于液面下1厘米，功率200w，超声3秒，间隔6秒，超声20～60次。然后4℃、12000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his-tag标签的氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶和苹果酸脱氢酶的粗酶液。
31.2)纯酶的制备：采用镍柱对步骤1)得到的粗酶液进行纯化并除盐；采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his-tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐，除盐后获得的液体即为带his-tag标签的氧化还原酶(氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶或苹果酸脱氢酶)的纯酶溶液。
32.3)羊毛的表面修饰：首先，称取九水合硫化钠、尿素和十二烷基硫酸钠，混合后加入到反应瓶中，加入超纯水使溶液体积达到50ml，硫化钠终浓度保持在不超过1000mm，将反应瓶放入超声清洗机中超声使固体物质完全溶解。称取羊毛加入到蓝口瓶中，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2，使羊毛完全浸没于尿素、硫化钠和十二烷基硫酸钠的混合溶液中，随后将蓝口瓶放入60℃恒温干燥箱中，保温处理不超过2.5h使羊毛鳞片破坏，暴露出活性基团，并保留羊毛纤维骨架，处理后用去离子水进行冲洗，洗净后放入纯净水中浸泡置于4℃冷藏备用。若保温处理时间过长超过3h后，羊毛容易溶解破坏，不再具有比较完整的骨架结构。
33.4)表面修饰后的羊毛固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛浸入到步骤2)得到的带his-tag标签的氧化还原酶，并使带his-tag标签的氧化还原酶的终浓度为0.1～10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡2h，羊毛与氧化还原酶结合完成后加入0～2.5％化学交联剂(1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或戊二醛(ga))进行交联或者0.8～40mm金属离子(mg
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等)进行配位，交联或者配位0～1h，结束后洗净即得表面修饰后的羊毛固定化氧化还原酶。
34.5)羊毛固定化氧化还原酶柱反应器的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛将其填充到柱反应器中，使柱子中的羊毛填充紧密结实。填充部分的长径比为1:1～10:1。将反应器搭建起来后接入蠕动泵，用pbs缓冲液进行从下而上进行循环，平衡柱子。将柱子中缓冲液排干后接入步骤2)得到的带his-tag标签的氧化还原酶，并使带his-tag标签的氧化还原酶的终浓度为0.1～100mg/ml，0～50℃循环固定化0～2h，羊毛与氧化还原酶结合完成后接入0～2.5％化学交联剂(1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或戊二醛(ga))进行交联或者0.8～40mm金属离子(mg
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等)进行配位，循环交联或者配位0.1～1h，结束后用pbs缓冲液进行洗柱，即得羊毛固定化氧化还原酶柱反应器。
35.6)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 8～12浓度范围为50～200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物包括2-氧代-基丁酸乙酯、苯丙酮酸或α-酮戊二酸，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
36.胺脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 8～12浓度范围为50～200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物包括苯乙酮、苯丙酮、苯己酮或1-羟基-2-丁酮，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
37.苹果酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 8～12浓度范围为50～200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物为苹果酸，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
38.本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
aadh质粒。将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
54.重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200ml lb培养基中。lb培养基的组成为10.0g/l胰蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，10g/l nacl。培养条件为：起始ph 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂iptg，使其终浓度为10mg/ml，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。
55.培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph＝7～7.4)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(ph 7～7.4)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
56.将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200w。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的粗酶液。
57.(2)氨基酸脱氢酶纯酶制备：采用ge公司的his trap镍柱(histrap
tm hp，5ml)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用pall公司的10k的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his-tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为纯化的带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的纯酶溶液。
58.(3)羊毛的表面修饰：首先，称取6克九水合硫化钠，24克尿素和1.44克十二烷基硫酸钠，混合后加入到反应瓶中，加入超纯水使溶液体积达到50ml，硫化钠终浓度保持在500mm，将反应瓶放入超声清洗机中超声使固体物质完全溶解。称取5克羊毛加入到蓝口瓶中，使羊毛完全浸没于溶液中，随后将蓝口瓶放入60℃恒温干燥箱中，保温处理不超过2.5h使其鳞片破坏，暴露出活性基团，并保留完整骨架，处理后用去离子水进行冲洗，洗净后放入纯净水中浸泡置于4℃冷藏备用。结果如说明书附图1所示，分别为处理前的羊毛原始状态、以及分别经过保温处理0.5h、保温处理1.0h、保温处理1.5h、保温处理2.0h、保温处理2.5h得到的表面修饰的羊毛。由图1可知处理0.5h后的羊毛表面鳞片破坏较小，纤维骨架保留完整，酶分子不容易脱落，但负载较差；处理1.0h后的羊毛表面鳞片被破坏，基本纤维骨架保留完整，酶分子不容易脱落，负载较好；处理1.5h后的羊毛表面基本完全被破坏，基本纤维骨架也开始出现被破坏的迹象，酶分子容易脱落；处理2.0h及以上的羊毛表面完全被破坏，基本纤维骨架也被明显破坏，酶分子不易负载，容易脱落。
59.(4)表面修饰后的羊毛固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛浸入到步骤2)得到的带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的纯酶溶液中，并使带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡2h，表面修饰后的羊毛与氨基酸脱氢酶结合完成后加入终体积分数2.5％ga进行交联30min，或者加入终浓度10mm金属离子cu
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进行配位30min，结束后洗净即得表面修饰后的羊毛固定化氨基酸脱氢酶。当羊毛在硫化钠/尿素/十二烷基硫酸钠体系中处理1h时得到的表面修饰后的羊毛固定化酶负载能力最大，为1.52mg/g，选用该羊毛固定化酶在不同ph体系下进行酶活力的检测。
60.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度范围为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所
述底物为2-氧代-基丁酸乙酯，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
61.氨基酸脱氢酶酶活测定体系为不同ph的缓冲溶液(缓冲液ph包括7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0)，考察不同ph体系下对ga交联的羊毛固定化酶和金属离子cu
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进行配位后的羊毛固定化酶作用。结果如说明书附图2所示。
62.实施例2
63.(1)～(4)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(4)，其中羊毛在硫化钠/尿素/十二烷基硫酸钠体系中处理时间为1h。
64.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物为α-酮戊二酸，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
65.氨基酸脱氢酶酶活测定体系为不同温度的缓冲溶液(缓冲液温度包括30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)，考察反应体系不同温度下对ga交联的羊毛固定化酶和金属离子cu
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进行配位后的羊毛固定化酶作用。结果如说明书附图3所示。
66.实施例3
67.(1)～(4)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(4)，其中羊毛在硫化钠/尿素/十二烷基硫酸钠体系中处理时间为1h。
68.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度范围为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物为苯丙酮酸，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
69.(6)固定化酶温度温度稳定性的测定：将ga交联的羊毛固定化酶和金属离子cu
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进行配位后的羊毛固定化酶在60℃水浴恒温2.5h，在这个过程中每隔30min测定一次酶活。结果如说明书附图4所示。
70.实施例4
71.(1)粗酶液的制备：
72.构建可表达带his-tag标签的胺脱氢酶的重组表达菌株：胺脱氢酶(amdh)的基因序列如seq id no.2所示。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收amdh基因片段，用ndei和xhoi酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pet-28a质粒(带有his-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)，得到pet28a-amdh质粒。将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his-tag标签的胺脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
73.重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200ml lb培养基中。lb培养基的组成为10.0g/l胰蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，10g/l nacl。培养条件为：起始ph 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂iptg，使其终浓度为10mg/ml，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。
74.培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃
上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph＝7～7.4)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(ph 7～7.4)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
75.将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200w。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his-tag标签的胺脱氢酶的粗酶液。
76.(2)胺脱氢酶纯酶制备：采用ge公司的his trap镍柱(histrap
tm hp，5ml)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用pall公司的10k的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his-tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为纯化的带his-tag标签的胺脱氢酶的纯酶溶液。
77.(3)羊毛的表面修饰：首先，称取3克九水合硫化钠，12克尿素和0.72克十二烷基硫酸钠，混合后加入到反应瓶中，加入超纯水使溶液体积达到50ml，硫化钠终浓度保持在250mm，将反应瓶放入超声清洗机中超声使固体物质完全溶解。称取5克羊毛加入到蓝口瓶中，使羊毛完全浸没于溶液中，随后将蓝口瓶放入60℃恒温干燥箱中，保温处理不超过2.5h使其鳞片破坏，暴露出活性基团，并保留完整骨架，处理后用去离子水进行冲洗，洗净后放入纯净水中浸泡置于4℃冷藏备用。
78.(4)表面修饰后的羊毛固定化胺脱氢酶的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛浸入到步骤2)得到的带his-tag标签的胺脱氢酶的纯酶溶液中，并使带his-tag标签的胺脱氢酶的终浓度为10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡2h，表面修饰后的羊毛与胺脱氢酶结合完成后加入终体积分数2.5％edc进行交联30min，或者加入终浓度10mm金属离子mn
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进行配位30min，结束后洗净即得表面修饰后的羊毛固定化胺脱氢酶。
79.(5)酶活力的检测方法：胺脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物为苯丙酮，产物为苯丙胺，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
80.实施例5
81.(1)粗酶液的制备：
82.构建可表达带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的重组表达菌株：苹果酸脱氢酶(mdh)的基因序列如seq id no.3所示。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收mdh基因片段，用ndei和xhoi酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pet-28a质粒(带有his-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)，得到pet28a-mdh质粒。将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
83.重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200ml lb培养基中。lb培养基的组成为10.0g/l胰蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，10g/l nacl。培养条件为：起始ph 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂iptg，使其终浓度为10mg/ml，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。
84.培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃
上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph＝7～7.4)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(ph 7～7.4)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
85.将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200w。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的粗酶液。
86.(2)苹果酸脱氢酶纯酶制备：采用ge公司的his trap镍柱(histrap
tm hp，5ml)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用pall公司的10k的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his-tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为纯化的带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的纯酶溶液。
87.(3)羊毛的表面修饰：首先，称取3克九水合硫化钠，12克尿素和0.72克十二烷基硫酸钠，混合后加入到反应瓶中，加入超纯水使溶液体积达到50ml，硫化钠终浓度保持在250mm，将反应瓶放入超声清洗机中超声使固体物质完全溶解。称取5克羊毛加入到蓝口瓶中，使羊毛完全浸没于溶液中，随后将蓝口瓶放入60℃恒温干燥箱中，保温处理不超过2.5h使其鳞片破坏，暴露出活性基团，并保留完整骨架，处理后用去离子水进行冲洗，洗净后放入纯净水中浸泡置于4℃冷藏备用。
88.(4)表面修饰后的羊毛固定化苹果酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛浸入到步骤2)得到的带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的纯酶溶液中，并使带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的终浓度为10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡2h，表面修饰后的羊毛与苹果酸脱氢酶结合完成后加入终体积分数2.5％nhs进行交联30min，或者加入终浓度10mm金属离子ni
2+
进行配位30min，结束后洗净即得表面修饰后的羊毛固定化苹果酸脱氢酶。
89.(5)酶活力的检测方法：苹果酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度范围为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物为苹果酸，产物为草酰乙酸，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
90.实施例6
91.(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)，其中羊毛在硫化钠/尿素/十二烷基硫酸钠体系中处理时间为1h。
92.(4)羊毛固定化氨基酸脱氢酶柱反应器的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛将其填充到玻璃层析柱中，使柱子中的羊毛填充紧密结实，填料长径设置为比为2.5。将反应器搭建起来后接入蠕动泵，用pbs缓冲液进行从下而上进行循环，平衡柱子。将柱子中缓冲液排干后接入步骤2)得到的带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的纯酶溶液，并使带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为20mg/ml，30℃循环固定化2h，羊毛与氨基酸脱氢酶结合完成后接入终体积分数2.5％化学交联戊二醛(ga)进行交联或者终浓度40mm金属离子cu
2+
进行配位，循环交联或者配位30min，结束后用pbs缓冲液进行洗柱，即得羊毛固定化氨基酸脱氢酶柱反应器。如说明书附图5所示。
93.(5)酶负载量的检测方法：在步骤4)中，将柱子中缓冲液排干后接入步骤2)得到的
带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的纯酶溶液，并使带his-tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为20mg/ml，30℃循环固定化2h，期间每隔一段时间取循环酶液20μl，使用考马斯亮蓝法测定蛋白含量的变化，原始酶液蛋白含量减去剩余蛋白含量计算即得负载量，如说明书附图6所示。
94.实施例7
95.(1)～(5)实验步骤如实施例6的步骤(1)～(5)。
96.(6)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度范围为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物包括2-氧代-基丁酸乙酯，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
97.(7)氨基酸脱氢酶活性测定反应体系的缓冲液接入羊毛固定化氨基酸脱氢酶柱反应器，柱反应器酶活测定的体系在蠕动泵里的流速设为不同的三个挡位(缓冲液流速包括2.6ml/min、4.6ml/min和8.6ml/min)，考察不同流速下对羊毛固定化氨基酸脱氢酶柱反应器的催化效率。如图7所示。8.6ml/min时的柱反应器催化效率最佳，即流速提高有利于连续性反应器的催化效率。
98.实施例8
99.(1)～(3)实验步骤如实施例4的步骤(1)～(3)。
100.(4)羊毛固定化胺脱氢酶柱反应器的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛将其填充到柱反应器中，使柱子中的羊毛填充紧密结实，填料长径设置为比为2.5。将反应器搭建起来后接入蠕动泵，用pbs缓冲液进行从下而上进行循环，平衡柱子。将柱子中缓冲液排干后接入步骤2)得到的带his-tag标签的胺脱氢酶的纯酶溶液，并使带his-tag标签的胺脱氢酶的终浓度为20mg/ml，30℃循环固定化2h，羊毛与胺脱氢酶结合完成后接入终体积分数2.5％化学交联(1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化亚胺盐酸盐(edc)进行交联或者终浓度40mm金属离子zn
2+
进行配位，循环交联或者配位30min，结束后用pbs缓冲液进行洗柱，即得羊毛固定化胺脱氢酶柱反应器。
101.(5)酶活力的检测方法：胺脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度范围为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物包括苯乙酮，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
102.(6)胺脱氢酶活性测定反应体系的缓冲液接入羊毛固定化胺脱氢酶柱反应器，柱反应器酶活测定的体系在蠕动泵里的流速设为不同的三个挡位(缓冲液流速包括2.6ml/min、4.6ml/min和8.6ml/min)，考察不同流速下对羊毛固定化胺脱氢酶柱反应器的催化效率。
103.实施例9
104.(1)～(3)实验步骤如实施例5的步骤(1)～(3)。
105.(4)羊毛固定化苹果酸脱氢酶柱反应器的制备：在步骤3)得到的表面修饰后的羊毛将其填充到柱反应器中，使柱子中的羊毛填充紧密结实，填料长径设置为比为2.5。将反应器搭建起来后接入蠕动泵，用pbs缓冲液进行从下而上进行循环，平衡柱子。将柱子中缓
冲液排干后接入步骤2)得到的带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的纯酶溶液，并使带his-tag标签的苹果酸脱氢酶的终浓度为20mg/ml，30℃循环固定化2h，羊毛与苹果酸脱氢酶结合完成后接入终体积分数2.5％化学交联n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)进行交联或者终浓度40mm金属离子ni
2+
进行配位，循环交联或者配位30min，结束后用pbs缓冲液进行洗柱，即得羊毛固定化苹果酸脱氢酶柱反应器。
106.(5)酶活力的检测方法：苹果酸脱氢酶的活性测定反应体系包含500μl，4mm nadh、8000μl，ph 9.5浓度范围为200mm的氯化铵-氨水作为氨基供体、500μl，40mm的底物溶液，所述底物为苹果酸，每隔1min取样测定反应液340nm波长下的吸光度。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
107.(6)苹果酸脱氢酶活性测定反应体系的缓冲液接入羊毛固定化苹果酸脱氢酶柱反应器，柱反应器酶活测定的体系在蠕动泵里的流速设为不同的三个挡位(缓冲液流速包括2.6ml/min、4.6ml/min和8.6ml/min)，考察不同流速下对羊毛固定化苹果酸脱氢酶柱反应器的催化效率。
108.以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。