一种布美诺肽的制备方法与流程

本发明涉及多肽药物制备领域，具体涉及一种布美诺肽的制备方法。

背景技术：

1、妇女绝经前机能减退性欲障碍(hsdd)是女性常见性功能障碍之一,全球育龄妇女患病率6％-10％。主要表现为性欲降低，同时带来精神压力，影响妇女的情感健康、家庭和谐、人际关系和总体生活质量。

2、布美诺肽，英文名称bremelanotide,是由美国palatin技术公司开发的一种黑皮质素受体-4(mc4r)激动药，通过激活大脑中的内源性途径来调节性欲和性反应，用于治疗患有获得性广泛性性欲低下的绝经前女性。目前已完成临床iii期研究，该药于2019年6月12日获得美国fda批准上市，皮下注射液的商品名为成为第二款获得fda批准针对妇女绝经前机能减退性欲障碍(hsdd)治疗的药物。目前中国未批准任何治疗hsdd的药物上市，因此，布美诺肽有着广阔的市场前景。

3、布美诺肽是α-黑素细胞刺激激素(α-msh)合成多肽的类似物，含7种氨基酸的黑皮质素(melanocortin)环状多肽衍生物,cas号为1607799-13-2，是c端为羧酸的环七肽，其中，含有非天然氨基酸：d型的苯丙氨酸和nle正亮氨酸，asp侧链羧基与lys侧链的氨基以酰胺键成环。n端偶联nle，并乙酰化封端。氨基酸序列为：ac-nle-cyclo[asp-his-d-phe-arg-trp-lys]-oh。化学结构如下：

4、

5、专利cn101092451a公开了一种固相合成布美诺肽方法，使用pam树脂，依次偶联氨基酸，得到fmoc保护的肽树脂，脱除asp侧链β-cooh保护基和lys侧链ε-nh2保护基，固相缩合成环，再脱除n端的fmoc，乙酰化封端，hf裂解即得。该工艺使用到易腐蚀的hf裂解，对环境不友好，不利于规模化放大生产。

6、专利cn101280005a公开了一种固相合成布美诺肽的方法，首先使用wang树脂固相合成肽树脂，脱除保护基后，固相上环化，裂解。然而asp(o-2-phipr)和lys(mmt)片段氨基酸价格昂贵，使用低浓度tfa选择性脱保护可能导致asp和lys上保护基脱除不彻底。

7、专利cn110746486a公开了一种布美诺肽的固液相1+6合成方法。固相合成6肽片段后再在液相中与lys(boc)-ome合成全保护7肽甲酯，裂解得到线性七肽甲酯，再将线性七肽甲酯的asp侧链的β-cooh与lys侧链ε-nh2用缩合剂成环。该工艺在裂解得到线性七肽甲酯后形成酰胺键，由于此时线性七肽甲酯已经是去保护状态，因此在形成酰胺键时容易产生较多杂质，且裂解时优先选择了含硫试剂，气味刺鼻，不利于环保。

8、专利cn110950933a公开了一种布美诺肽的固液相2+5合成方法。通过液相法合成ac-nle-asp-o-2-phipr二肽片段，在lys的主链和侧链分别进行偶联延长肽序，得到全保护肽树脂，在his的α-nh2和asp的α-cooh固相成酰胺键环化。该法避免了首尾折叠成环，然而二肽片段ac-nle-asp-o-2-phipr合成成本高，价格昂贵，工艺中需要使用到水合肼脱保护，对环境不友好；且二肽片段偶联在c端lys上，lys与树脂接触，偶联完后还需偶联其他氨基酸，因位阻作用后续偶联效果较差，偶联效率会降低。

9、布美诺肽是由7个氨基酸组成的环肽，该肽合成的难点在于分子内环酰胺键的构建，现有的布美诺肽的制备方法成环位点主要集中在asp侧链β-cooh与lys侧链ε-nh2及asp的α-cooh与his的α-nh2。现有技术的合成策略中，采用此两种成环位点制备得到布美诺肽，会存在如下缺点：采用昂贵的氨基酸物料，如asp(o-2-phipr)、lys(mmt)等，导致合成成本高，工艺步骤繁琐；有些裂解试剂和脱保护试剂(hf、含硫试剂、水合肼等)对环境不友好；二肽片段偶联在c端lys上时，空间位阻作用导致偶联效果差；线性七肽甲酯处于去保护状态，形成酰胺键时容易导致粗肽中产生的杂质多，粗品不易纯化，不利于工业大规模生产。

10、因此，提供一种可以减少杂质的产生，粗品易于纯化，成品收率和纯度高，有利于环保要求，适合大批量生产的布美诺肽的制备方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种新的布美诺肽的制备方法，该方法主要包括如下步骤：

2、合成得到全保护的线性布美诺肽肽树脂，之后经裂解、环化、脱保护得环七肽酯，经水解制得布美诺肽粗品；

3、全保护的线性布美诺肽肽树脂为：

4、

5、其中，x选自trt或boc；

6、y选自甲酯、乙酯或苄酯。

7、进一步地，制得布美诺肽粗品步骤具体为：

8、步骤1)：合成三肽片段fmoc-lys(ac-nle-asp)-y；

9、步骤2)：通过固相合成法，偶联fmoc-trp(boc)-oh到固相载体树脂上，得到fmoc-trp(boc)-树脂；

10、步骤3)：取步骤2)所得的fmoc-trp(boc)-树脂，在缩合剂下依次偶联相应的保护氨基酸或片段以及步骤1)合成的三肽片段，得到全保护的线性布美诺肽肽树脂；

11、步骤4)：取步骤3)所得的线性布美诺肽肽树脂，经裂解、环化、脱保护，得到环七肽甲酯；

12、步骤5)：取步骤4)所得的环七肽甲酯，加入碱性试剂，在反应溶剂中水解甲酯，得到布美诺肽粗品。

13、步骤1)中合成的三肽片段位阻较大，在进行步骤3)中的固相偶联时放在氮端较合适，可以有效避免因位阻大带来的偶联效率低的问题。

14、在一些实施例中，步骤1)中的三肽片段fmoc-lys(ac-nle-asp)-y通过液相法合成，具体为：h-asp-otbu与ac-nle-osu反应得到ac-nle-asp-otbu，随后将其与hosu反应生成活泼酯ac-nle-asp(osu)-otbu；将活泼酯与fmoc-lys-y缩合得到fmoc-lys(ac-nle-asp-otbu)-y；最后脱除保护基得到fmoc-lys(ac-nle-asp)-y。

15、在一些实施例中，步骤1)中的三肽片段fmoc-lys(ac-nle-asp)-y也可以通过液相法先合成三肽片段fmoc-lys(h-nle-asp)-y，再将其进行乙酰化，具体为：h-asp-otbu与boc-nle-osu反应得到boc-nle-asp-otbu，随后将其与hosu反应生成活泼酯boc-nle-asp(osu)-otbu；将活泼酯与fmoc-lys-y缩合得到fmoc-lys(boc-nle-asp-otbu)-y；脱除保护基得到fmoc-lys(h-nle-asp)-y,最后与醋酸酐反应得到fmoc-lys(ac-nle-asp)-y。

16、进一步地，步骤2)中的固相载体树脂选自：2-ctc树脂，树脂替代度为0.8-1.2mmol/g。

17、本发明所述保护基是在多肽合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、羟基等基团在合成过程中免受干扰的保护基团，防止氨基、羧基、羟基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护基氨基酸。对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基、羟基等基团，作为优选，步骤3)采用逐步偶联的方法依次偶联：fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-d-phe-oh、fmoc-his(trt)-oh或fmoc-his(boc)-oh。

18、进一步地，步骤3)中的缩合剂为dic/hobt、edci/hobt、pybop/diea、tbtu/diea、hbtu/diea中的一种或几种。作为优选，缩合剂选自tbtu/diea或dic/hobt。

19、进一步地，步骤4)中裂解所需裂解液选自tfe与dcm的混合物，其中tfe占混合物的体积比为20％～50％，优选tfe占比20％，此浓度条件下裂解，切割树脂的效果最好。

20、进一步地，步骤4)中环化要在有机溶剂中使用缩合剂环化；其中有机溶剂为dmf、dcm或thf，缩合剂为dic/hobt、edci/hobt、pybop/diea、tbtu/diea、hbtu/diea中的一种，优选edci/hobt、pybop/diea、hbtu/diea，更优选为pybop/diea，这些缩合剂适合在液相条件下成环。

21、进一步地，步骤4)中脱保护所需脱保护试剂为tfa，tis和h2o的混合试剂，其体积比为tfa：tis：h2o＝90～98:1～5:1～5，作为优选，tfa：tis：h2o＝95:2.5:2.5。

22、进一步地，步骤5)中碱性试剂为lioh、naoh、koh中的一种，优选为lioh；反应溶剂为乙醇/水、甲醇/水、乙腈/水中的一种，其中有机溶剂占比10-50％，优选为20％。

23、进一步地，取步骤5)所得的布美诺肽粗品进行纯化，转盐，浓缩，冻干后得到醋酸布美诺肽。具体为：粗品用水溶解，经0.45μm滤膜过滤，用10mm-100mm硫酸钠/乙腈溶液进行一步纯化，再经10mm-100mm醋酸铵转盐，用0.05％～0.5％醋酸/乙腈体系梯度洗脱，合并纯度大于99％的馏分后，浓缩、冻干，即得。

24、本发明提供了一种布美诺肽的制备方法，采用固液相结合的方式，液相合成三肽片段fmoc-lys(ac-nle-asp)-y，随后固相合成环七肽甲酯，裂解切割树脂后，环化、去保护和水解得到布美诺肽粗品。该方法成环位点为trp的α-cooh与lys的α-nh2，由于trp的自身性质原因使得这2个氨基酸在环化时不容易发生消旋现象，从而减少消旋杂质的产生，解决了目前大多数专利中仅仅局限于lys与asp之间的成环导致杂质多的问题，同时又可提高反应收率。且此工艺操作简单，脱保护试剂避免了含硫试剂的使用，无难闻气味，有利于环保要求。粗品易于纯化，纯化工艺简单，且成品的收率和纯度较高，适合大批量生产。