与植物耐低氮胁迫相关的基因、启动子及其应用

1.本发明属于植物基因工程领域，涉及ntiaa26基因，特别是指与植物耐低氮胁迫相关的基因、启动子及其应用。


背景技术：

2.氮素是植物生长发育所需的重要元素之一，是植物体内蛋白质、核酸、磷脂和某些生长激素的重要组成成分。植物主要从环境中获取氮素来供给自身的生长发育，但因生物及非生物因素制约着植物对氮素的吸收、运输及同化作用，我国农业生产中通常通过施加氮肥来保证充足的氮素供给，但过量施用氮肥会造成土壤、水体污染、富营养化等不可逆伤害，而且植物对氮肥的利用率也未见增加，增加成本，造成资源浪费。因此，提高农业生产中氮素利用效率可以减少氮肥施用，进而对生态系统的污染防治具有重要意义。
3.生长素/吲哚-3-乙酸（aux/iaa）蛋白作为响应生长素信号的关键因子，在生长素信号转导过程中起重要的调控作用。aux/iaa 基因家族是一个生长素诱导表达的多基因家族，包含四个保守的结构域i、ii、iii和iv。结构域i具有转录抑制功能。结构域ii是生长素信号转导的必需元件，与f-box蛋白tir1相互作用，导致aux/iaa的不稳定性和快速降解。结构域iii和iv能与其他aux/iaa或arf相互作用，形成同源二聚体和异源二聚体，抑制生长素反应基因转录，影响信号转导。aux/iaa家族基因已在许多植物中得到鉴定分析，在拟南芥中有29个，在水稻中有31个，在马铃薯中有26个等。aux/iaa家族对植物的生长发育起着重要的调控作用，并且可能提高植株对生物胁迫和非生物胁迫的耐受性。近年来，关于aux/iaa家族基因参与植物低氮等营养胁迫的研究逐渐被报道，但关于植物中调控生长发育和参与低氮胁迫的关键基因及调控机制仍不清楚。
4.烟草是我国重要的经济作物，也可用来作为揭示调控植物生长发育机制的模式作物。目前对烟草基因组数据的生物信息学分析表明，烟草中至少有77个aux/iaa成员，但这些成员的功能仍不清楚。前期，我们从转录组数据库中发现烟草生长素抑制基因ntiaa26的表达增强可能与氮素相关，因此深入研究低氮胁迫下烟草生长素抑制基因ntiaa26的调控机制对于提高植物的氮素吸收和利用效率至关重要。可为选育烟草氮高效利用品种提供理论依据。
5.由于35s强启动子构建的过表达容易造成烟草某些生理发育受到影响，因此使用诱导性启动子将更有利于植物的生长发育。烟草作为我国重要的经济作物，大量氮肥的使用会影响烟草的质量，产生黑暴烟叶，同时成本增加、收入降低、环境受到影响。因此探寻一种提高烤烟耐低氮能力的基因和启动子，并对该基因进行深入研究是一个迫切且有重大意义的课题。


技术实现要素：

6.本发明提出一种与植物耐低氮胁迫相关的基因、启动子及其应用，通过构建低氮诱导特异启动子启动ntiaa26基因，创制耐低氮胁迫的烤烟新品系，为培育氮高效新品种提
供思路和方法。本技术利用低氮诱导特异启动子iaa26，构建过量表达载体，创制了耐低氮胁迫烤烟新品系，对减少氮肥施用，减少成本和环境污染具有重要的应用价值。
7.本发明的技术方案是这样实现的：与植物耐低氮胁迫相关的基因，所述基因为ntiaa26，序列如seq id no.1所示。
8.启动上述的基因的启动子，所述启动子的序列如seq id no.2所示。
9.含上述的基因的过表达载体，所述过表达载体以上述的启动子进行控制。
10.上述的过表达载体在提高烟草耐低氮胁迫中的应用。
11.上述的过表达载体在培育高效利用氮素烤烟新品种中的应用。
12.上述的应用，步骤如下：构建以上述启动子启动与植物耐低氮胁迫相关的基因的过表达载体，然后遗传转化至不耐低氮的烟草品种k326中，培育高效利用氮素烤烟新品种。
13.本发明具有以下有益效果：1、本发明利用农杆菌转化法获得了ntiaa26过表达载体，发现该ntiaa26基因在低氮胁迫下，通过调控抗氧化相关基因以及硝酸盐转运蛋白nrt1和nrt2基因家族相关基因的表达，提高烟株的氮素积累量和氮素利用效率，进而调控烟株在低氮胁迫下的生长发育，提高烟株的对低氮胁迫的耐受性，能够为培育耐低氮烤烟新品种提供理论依据。
14.2、本技术发现ntiaa26在茎中表达量最高, 老叶中其次, 新叶中最低 (图4a)。进一步测定了培养21天整株烟苗在不同胁迫下（缺n、缺p、缺k、缺ca、缺mg），ntiaa26基因的相对表达水平。结果显示，低氮胁迫上调烟草中ntiaa26基因的表达（图4b）。这些发现表明，ntiaa26基因参与了植物生长发育，并且可以调控低氮胁迫下ntiaa26基因表达。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为ntiaa26在烟草表皮细胞中的亚细胞定位图。
17.图2为本发明实施例提供的ntiaa26在烟草不同部位和不同缺素胁迫下的表达模式。
18.图3为本发明实施例提供的野生型烟草（wt）和proiaa26::iaa26转基因材料在不同氮素供应条件下的表型特征生物量、叶绿素和抗氧化能力。
19.图4为本发明实施例提供的的野生型烟草（wt）和proiaa26::iaa26转基因材料的氮素吸收速率和氮素利用效率。
20.图5为本发明实施例提供的的野生型烟草（wt）和proiaa26::iaa26转基因材料的硝酸盐转运蛋白基因表达情况。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发
明保护的范围。
22.与植物耐低氮胁迫相关的基因，所述基因为ntiaa26，序列如seq id no.1所示。
23.启动上述的基因的启动子，所述启动子的序列如seq id no.2所示。
24.含上述的基因的过表达载体，所述过表达载体以上述的启动子进行控制。
25.上述的过表达载体在提高烟草耐低氮胁迫中的应用。
26.上述的过表达载体在培育高效利用氮素烤烟新品种中的应用。
27.上述的应用，步骤如下：构建以上述启动子启动与植物耐低氮胁迫相关的基因的过表达载体，然后遗传转化至不耐低氮的烟草品种k326中，培育高效利用氮素烤烟新品种。
28.实施例1针对现有技术未对ntiaa26进行克隆和表达，本发明从烟草k326中克隆到ntiaa26基因，构建ntiaa26基因的过表达载体并进行遗传转化，获得ntiaa26过表达转基因植株，利用野生型烟草k326和ntiaa26过表达转基因植株分析了低氮胁迫下植株的生物量、抗氧化能力、氮素积累量和利用效率、硝酸盐转运蛋白相关基因表达水平，经分析发现ntiaa26基因过量表达可以调控烟株在低氮胁迫下的生长发育，提高烟株的对低氮胁迫的耐受性，烟草生长素抑制基因ntiaa26的序列如seq id no.1所示，启动子序列如seq id no.2所示。
29.烟草生长素响应基因ntiaa26的克隆方法具体包括：第一步：烟草叶总rna的提取；以k326幼叶为材料，使用eastep
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super total rna extraction kit（上海普洛麦格生物产品有限公司）试剂盒提供的方法提取总rna，测定所提总rna的od260/280值，并用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；第二步：烟草叶总cdna和基因组总dna的获得；以k326幼叶总rna样品1ug为模版，使用hiscript
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iii 1st strand cdna synthesis kit (+gdna wiper)试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）进行反转录，得到cdna；烟草基因组总dna的提取采用北京全式金生物技术有限公司的easypure plant genomic dna kit参照说明书进行提取；在本发明的优选实施例中，反转录条件为：42℃ 40min，50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。
30.第三步：烟草ntiaa26基因克隆引物设计；通过烟草aux/iaa基因家族的系统进化分析获得ntiaa26基因的编码区序列和基因组dna序列，利用dnaman v6.0软件对多肽序列进行比对，选择ntiaa26基因特异的位点进行引物设计，设计出ntiaa26基因全长cdna和基因组dna序列扩增及真核表达载体构建的引物ntiaa26-f序列如表1所示；ntiaa26-r序列如表1所示：表1在本发明的优选实施例中，真核表达载体为prontiaa26启动目的基因cambia1305
改造载体。
31.第四步：烟草ntiaa26基因的pcr扩增。以烟草幼叶cdna第一链和基因组总dna各1 μl为模版，采用标准的50 ulpcr反应体系，以phusion超保真dna聚合酶扩增ntiaa26基因全长cdna和基因组dna序列；在本发明的优选实施例中，pcr扩增cdna的参数如下：94℃预变性4min，35个循环，72℃保温10min。基因组dna扩增时，其延伸的时间增加至3min；循环的过程为94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min。
32.本发明实施例提供的过表达载体构建方法具体包括：过表达载体构建及检验。为构建过表达载体prontiaa26-pcambia1305，首先，使用引物扩增ntiaa26的整个编码序列(cds)，构建35s启动子启动ntiaa26的中间载体，然后更换载体启动子，通过酶切构建ntiaa26启动子启动ntiaa26的表达载体；挑选阳性克隆进行菌液pcr鉴定，并送阳性克隆子测序，验证序列正确，载体构建成功；烟草(nicotianatabacum cv, k326)叶片rna提取及cdna合成用trizol plus提取烟草k326叶片rna，取1μg总rna反转录为cdna模板。以烟草cdna为模板，利用特异性引物进行pcr扩增, 获得ntiaa26基因片段,ntiaa26在烟草表皮细胞中的亚细胞定位为了分析亚细胞定位，将没有末端密码子的 ntiaa26 cdna 融合到 pcam35s 载体中绿色荧光蛋白 (gfp) 基因的 n 末端。 亚细胞定位在本氏烟草的叶表皮细胞中进行瞬时表达，并用 35s::gfp 对对照细胞进行相同的转化。 然后将转化的烟草表皮样品在25℃避光保存16小时。 通过共聚焦激光扫描显微镜（nikon c2-er）监测gfp的瞬时表达。结果如图1所示，ntiaa26定位于细胞核中。
33.确定ntiaa26是由低氮调节野生型(wt)烟草种子经消毒，均匀撒在海绵育苗盘中，并放置在恒温恒湿培养室中（白天28℃，14h，晚上22℃，10h，每24h循环；湿度设置为60％）。为了检测不同烟草组织中ntiaa26基因的组织特异性表达，对培养10周的烟草的根、茎、新叶和老叶进行分部位取样，（新叶为完全展开的叶片从上往下数第二片，老叶为完全展开的叶片从上往下数第七片，）并采用qrt-pcr方法测定，结果表明，ntiaa26在茎中表达量最高, 老叶中其次, 新叶中最低 (图2a)。进一步测定了培养21天整株烟苗在不同胁迫下（缺n、缺p、缺k、缺ca、缺mg），ntiaa26基因的相对表达水平。结果显示，低氮胁迫上调烟草中ntiaa26基因的表达（图4b）。这些发现表明，ntiaa26基因参与了植物生长发育，并且可以调控低氮胁迫下ntiaa26基因表达。
34.获得ntiaa26过表达转基因烟草植株用表1中的特异性引物从烟叶中扩增出ntiaa26的cds，用于ntiaa26的过表达。将pcr产物连接到由花椰花花叶病毒（camv）35s启动子和nopaline合酶终止子驱动的pcambia 1305载体上。通过电泳将构建物转移到agrobacteriumtumefaciens菌株eha105，转化到烟草(nicotianatabacum cv，k326)中去。通过引入ntiaa26过表达结构，获得了10个转基因烟草株系。分析鉴定了两个过量表达效果较好的两个转基因株系(命名为ox1和ox2)在本研究中被证实和使用。
35.验证ntiaa26过表达转基因烟草对低氮胁迫的耐受性。通过引入ntiaa26过表达结
构，野生型烟草(wt)种子和ntiaa26-ox转基因烟草种子(t2代)经消毒，均匀撒在海绵育苗盘中，并放置在恒温恒湿培养室中（白天28℃，14h，晚上22℃，10h，每24h循环；湿度设置为60％）。当种子发芽时，长成两片叶子，开始添加1/4 hoagland营养液4天，然后添加1/2 hoagland营养液4天，然后添加hoagland营养液7天。约21天的烟苗用于nacl (150mmol/l) 胁迫处理7天，收获烟草幼苗，用去离子水冲洗叶和根。
36.实施效果例分析对野生型和转基因株系样品进行以下研究：1. 研究烟草的表型特征和生物量（图3a，b）；表明与对照相比，在低氮胁迫条件下，ntiaa26-ox转基因植株的长势和生物量显著优于wt植株。
37.2. 测定叶绿素含量（图3c）；表明与对照相比，在低氮胁迫条件下，ntiaa26-ox转基因植株的叶绿素含量显著高于对照wt。
38.3. 测定抗氧化酶sod和pod的活性（图3d，e）；在低氮胁迫条件下，ntiaa26-ox转基因烟草的sod、pod的活性明显高于野生型。这表明ntiaa26的过表达可以增强烟草的抗氧化能力。
39.4. 测定氮素积累量和氮素利用效率（图4）；低氮处理24h时，与对照wt相比，ntia26过表达转基因株系ox1、ox2的氮素积累量和氮素利用效率均显著高于对照。低氮处理降低烟株对氮素的吸收和利用，ntiaa26过表达可以增强烟草对氮素的积累与利用。
40.5.测定硝酸盐转运蛋白基因ntnrt1.1、ntnrt1.5、ntnrt1.7、ntnrt2.5的表达水平（图5）；在低氮胁迫条件下，ntiaa26-ox转基因烟草的ntnrt1.1、ntnrt1.5、ntnrt2.5基因表达量明显高于野生型，而ntnrt1.7基因表达量显著低于野生型。
41.以上结果表明ntiaa26基因的过表达可以调控烟株在低氮胁迫下的生长发育，提高烟株的对低氮胁迫的耐受性，为耐盐烟草栽培技术和烟叶的综合利用提供依据。
42.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。