一株同步异养硝化好氧反硝化除磷菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa) sndp-01及其应用。该菌株具有同步异养硝化好氧反硝化并过量吸磷的功能，将该菌株接种到生活污水中，可以在一个反应器内实现废水的同步脱氮除磷。


背景技术：

2.随着社会的进步和经济的发展，富含氮磷的生活污水和工业废水的过量排放使得我国各类水体的富营养化问题逐渐突出，不仅给水体生态系统造成了损害，也给人类的健康带来了巨大的威胁。因此，限制出水中氮磷的浓度对于污水处理厂来说至关重要。污水的处理方法主要分为化学法、物理法和生物法，其中，生物治理法因其具有效率高、成本低、环境友好等特点被广泛应用于生活污水处理中。
3.在传统的生物脱氮除磷工艺中，污水中的氨氮首先在好氧条件下发生自养硝化作用氧化为亚硝态氮或硝态氮，然后在厌氧条件下发生异养反硝化作用还原为氮气；而污水中的正磷酸盐在异养的聚磷菌(paos)的作用下，在好氧条件被过量吸收至胞内以聚磷颗粒的形式存储，厌氧条件下分解聚磷释放正磷酸盐，通过排泥的方式将体系内的磷去除。因此，传统的去除工艺需要厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化的分段处理，这不仅增加了设备的复杂性，还增加了占地面积和运行成本。另外，异养反硝化菌和聚磷菌对于碳源的竞争也不利于构建一个稳定且可持续的脱氮除磷生物系统。因此，最好的解决方法是将这些独立的过程结合起来实现在单个反应器内的同步脱氮除磷。
4.近年来，一些同步异养硝化好氧反硝化除磷菌(sndpr)的发现使得这种设想成为了可能，这些菌株能在好氧的条件下将氨氮转化为氮气，同时也能吸收过量的正磷酸盐进入胞内，这使得脱氮除磷过程能够在一个反应器内完成，且不存在不同功能菌株的对底物的竞争问题，不仅能够减少反应器数量，简化脱氮过程，而且能够降低运行成本。
5.然而，目前分离出来的sndpr菌数量较少，且这些菌株大都存在厌氧释磷的问题，容易造成水体的二次污染。因此，发现和分离更多具有异养硝化好氧反硝化能力的除磷菌将有利于扩大该类微生物的应用领域，促进对微生物在自然界作用的认知。
6.本发明从污水处理厂的二沉池的活性污泥中筛选出一株具有异养硝化好氧反硝化功能的除磷菌。在严格的好氧条件下，该菌株能够实现高效的同步脱氮除磷功能，且去除的磷以磷单酯的形式储存在胞外分泌物(eps)中，不存在厌氧磷酸盐的释放，有利于磷的资源回收。


技术实现要素：

7.本发明提供了一株具有异养硝化好氧反硝化能力的除磷菌
‑‑
铜绿假单胞菌 (pseudomonas aeruginosa)sndp-01，该菌突破了传统生物脱氮除磷理论的限制，能够在一个反应器内实现同步脱氮除磷。
8.本发明提供了铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01在实际生活污水
处理中的应用，将该菌接种至高氮磷废水中，可以在一个好氧的单级反应器中同步脱氮除磷，克服了现有生物脱氮除磷工艺硝化过程、反硝化过程、吸/释磷过程需要分段进行的技术瓶颈，应用前景广阔，具有良好的经济和社会效益。
9.本发明所述的应用相较于传统生物脱氮除磷工艺而言，其特点在于硝化过程不是传统的自养条件而是异养条件，反硝化过程不是传统的厌氧条件而是好氧条件，除磷过程并非利用聚磷菌在厌氧/好氧交替的条件下进行，而是利用好氧摄磷菌在完全好氧的条件下进行。这就使得脱氮除磷过程在好氧异养的一个状态下由一种功能菌株完成，不需要复杂的条件变换，也不存在传统脱氮除磷工艺中发生的不同功能菌群的相互竞争问题。
10.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.23440，保藏日期为2021年9月17日。16s rdna核苷酸序列长度为1421bp。
11.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01生长于基础固体培养基上，基础固体培养基配制方法为：称取柠檬酸钠3.5833g、硫酸铵0.472g、磷酸氢二钾 0.075g、硫酸镁0.05g、氯化钠0.12g、微量元素1ml、琼脂15-20g，将上述药品溶于1l的去离子水中，121℃灭菌20min后倒入培养皿中制成固体培养基。
12.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01接种至固体基础培养基并培养48h后，呈现表面光滑湿润、中间略微凸起、边缘不规则的白色菌落，能分泌一种使培养基呈蓝绿色的水溶性色素。革兰氏染色呈阴性。扫描电镜结果显示该菌大小为 (1.5-5)μm
×
(0.5-1)μm，呈杆状或短杆状。
13.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01能够在好氧条件下以有机物为电子供体，将氨氮转化为亚硝态氮或硝态氮，实现异养硝化过程；也能在好氧条件以有机物为电子供体，将亚硝态氮或硝态氮还原为氮气，实现好氧反硝化过程；同时还能在好氧条件下以氨氮和亚硝态氮、氨氮和硝态氮为混合氮源实现同步硝化反硝化脱氮过程。
14.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01能够在好氧脱氮的同时将正磷酸盐转运至胞内最后主要以磷酸单酯的形式储存在eps中，实现不以厌氧释磷为前提的直接好氧吸磷过程。
15.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01发挥优良的同步脱氮除磷性能的最佳条件为：碳源为柠檬酸钠，c/n为10-15，p/n为0.1-0.2，培养温度为30-35℃， ph为7.5-8.5，转速为120-160rpm。
16.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01在好氧脱氮过程中不存在中间产物(no
2-和no
3-)的累积，具有良好的应用前景。
17.本发明提供的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01其好氧磷酸盐利用途径为：一部分正磷酸盐用于胞内代谢及合成细胞膜，另一部分正磷酸盐形成磷酸单酯后储存在eps中，不存在厌氧磷酸盐释放的过程，有利于磷元素的资源回收。
附图说明
18.图1为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01在不同培养条件下的生
长和脱氮除磷性能。
19.图2为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01以nh
4+
为唯一氮源进行同步异养硝化除磷过程的生长和脱氮除磷特性。
20.图3为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01分别以no
2-和no
3-为唯一氮源进行同步好氧反硝化除磷过程的生长和脱氮除磷特性。
21.图4为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01分别以nh
4+
和no
2-、nh
4+
和no
3-为混合氮源进行同步硝化反硝化除磷过程的生长和脱氮除磷特性。
22.图5为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01处理实际生活废水的脱氮除磷特性。
23.图6为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01异养硝化除磷的过程中磷的分布情况及eps中磷的存在形式。图7为eps上的磷的存在形式。
具体实施方式
24.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步的详细阐述，所述实施例仅用于解释本发明，并非限制本发明的范围。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
25.实施例中用到的培养基如下：
26.基础培养基：硫酸铵0.472g/l、三水磷酸氢二钾0.075g/l、硫酸镁0.050g/l、氯化钠 0.120g/l，硫酸亚铁0.010g/l、微量元素1ml/l。
27.硝化培养基：柠檬酸钠3.583g/l、硫酸铵0.472g/l、三水磷酸氢二钾0.075g/l、硫酸镁0.050g/l、氯化钠0.120g/l，硫酸亚铁0.010g/l、微量元素1ml/l。
28.反硝化培养基ⅰ：柠檬酸钠3.583g/l、亚硝酸钠0.493g/l、三水磷酸氢二钾0.075g/l、硫酸镁0.050g/l、氯化钠0.120g/l，硫酸亚铁0.010g/l、微量元素1ml/l。
29.反硝化培养基ⅱ：柠檬酸钠3.583g/l、硝酸钠0.607g/l、三水磷酸氢二钾0.075g/l、硫酸镁0.050g/l、氯化钠0.120g/l，硫酸亚铁0.010g/l、微量元素1ml/l。
30.混合氮源培养基ⅰ：柠檬酸钠3.583g/l、硫酸铵0.236g/l、亚硝酸钠0.246g/l、三水磷酸氢二钾0.075g/l、硫酸镁0.050g/l、氯化钠0.120g/l，硫酸亚铁0.010g/l、微量元素1ml/l。
31.混合氮源培养基ⅱ：柠檬酸钠3.583g/l、硫酸铵0.236g/l、硝酸钠0.304g/l、三水磷酸氢二钾0.075g/l、硫酸镁0.050g/l、氯化钠0.120g/l，硫酸亚铁0.010g/l、微量元素1 ml/l。
32.微量元素：硫酸锌1g/l、氯化锰0.3g/l、硼酸3g/l、氯化钴2g/l、氯化铜0.1g/l、氯化镍0.2g/l、钼酸钠0.3g/l。
33.本发明所使用的生活污水取自某化粪池的出水，基本组成成分包括god 170-210mg/l, nh
4+-n 62-75mg/l,no
2-‑
n 0.01-0.12mg/l,no
3-‑
n 0.2-1.2mg/l,po
43-‑
p 5.6-6.8mg/l。
34.实施例1
35.铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa sndp-01最佳同步脱氮除磷条件的优化。
36.将-20℃甘油保存的菌株(于2021年9月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为no.23440)接种于已灭菌的100ml基础培养基，置于30℃， 120rpm摇床内震荡培养18-20h，使菌体生长至对数后期，菌悬液用于接种(下同)。分别向5个含300ml液体基础培养基的锥形瓶中加入3.5833g柠檬酸钠、3.4167g乙酸钠、2.375g 蔗糖、2.5g葡萄糖和3.375丁二酸钠充当碳源，然后分别向其中接种3ml的菌悬液，置于 35℃、120rpm的气浴摇床中培养，第0h和第24h取样且于8000rpm离心10min后测定 nh
4+-n、po
43-‑
p的浓度和od
600
值。结果如图1a所示，当碳源为柠檬酸钠时菌株的氨氮和磷酸盐去除率最高，因此该菌发挥最优脱氮除磷能力的碳源条件为柠檬酸钠。
37.同理，以柠檬酸钠为碳源，调节基础培养基的c/n(质量比，下同)分别为2.5、5、 10、15和20，培养和测样条件同上。结果如图1b所示，当c/n＝10-15时菌株的氨氮和磷酸盐去除率最高，取c/n＝10-15为最佳c/n条件。
38.同理，在最佳碳源和c/n比条件下，调节基础培养基的p/n(质量比，下同)分别为 0.1、0.2、0.4、0.6和0.8，培养和测样条件同上。结果如图1c所示，当p/n＝0.1-0.2时菌株的氨氮和磷酸盐去除率最高，取p/n＝0.1-0.2为最佳p/n比条件。
39.同理，在最佳碳源为柠檬酸钠，c/n/p＝100/10/1(质量比，下同)的条件下，调节培养温度分别为20、25、30、35和40℃，测样条件同上。结果如图1d所示，当温度为30-35℃时菌株的氨氮和磷酸盐去除率最高，取30-35℃为最佳温度条件。
40.同理，在最佳碳源为柠檬酸钠，c/n/p＝100/10/1，温度为30-35℃的条件下，调节ph 分别为5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，培养和测样条件同上。结果如图1e所示，当ph＝7.5-8.5 时，氨氮和磷酸盐去除率最高，因此取ph＝7.5-8.5为最佳ph条件。
41.同理，在最佳碳源为柠檬酸钠，c/n/p＝100/10/1，温度为30℃，ph为7.5-8.5条件下，分别调节转速为40、80、120、160和200rpm，测样条件同上。结果如图1f所示，当转速为120-160rpm时，氨氮和磷酸盐去除率最高，因此取转速为120-160rpm为最佳转速条件。
42.综上所述，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01发挥最佳同步脱氮除磷条件为：碳源为柠檬酸钠，c/n为10-15，p/n为0.1-0.2，温度为30-35℃，ph为7.5-8.5，转速为120-160rpm。
43.实施例2
44.铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa sndp-01以氨氮为唯一氮源进行同步硝化除磷时的生长和污染物去除特性。
45.接种3ml菌悬液至含300ml液体硝化培养基的锥形瓶中，培养条件为30℃，120rpm。每隔4h测定nh
4+-n、no
2-‑
n和no
3-‑
n、po
43-‑
p的浓度和od
600
值。
46.结果如图2所示。菌株接种后迅速进入对数期，在第24h进入短暂的稳定期并迅速衰亡。菌株在生长的同时分解nh
4+-n并吸收po
43-‑
p，最大nh
4+-n去除速率为6.62mg n/(l/h)，最大po
43-‑
p去除速率为1.03mg p/(l/h)。在第20h，nh
4+-n去除率达到最大值82％，第 24h，po
43-‑
p的去除率达到最大值97％。另外，nh
4+-n的降解过程中几乎没有no
2-‑
n和 no
3-‑
n积累。随着菌株的衰亡，部分胞内氮和磷的溶出导致氨氮和磷的浓度在第24h开始上升。
47.实施例3
48.铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa sndp-01以亚硝态氮、硝态氮为唯一氮源进行同步反硝化除磷时的生长和污染物去除特性。
49.接种3ml的菌悬液至含300ml液体反硝化培养基i和反硝化培养基ⅱ的锥形瓶中，置于气浴摇床(30℃，120rpm)中培养32h，每隔4h测定nh
4+-n、no
2-‑
n和no
3-‑
n、po
43-‑
p 的浓度和od
600
值。
50.在以高浓度的亚硝态氮(100mg/l)为底物的反硝化除磷过程中(图3a)，菌株在接种后的第8h进入对数期，第24h进入稳定期。一部分的no
2-‑
n被菌株同化用于生长繁殖，另一部分的no
2-‑
n通过好氧反硝化作用去除，最大no
2-‑
n去除速率为12.83mg n/(l/h)。同时，反硝化过程中po
43-‑
p的浓度快速下降，最大po
43-‑
p去除速率为0.64mg p/(l/h)。在第28h，no
2-‑
n去除率达到100％，po
43-‑
p的去除率达到最大值91％。另外，no
2-‑
n的降解过程中几乎没有nh
4+-n的积累，虽然前期有少量的no
3-‑
n生成，但第28h后被完全降解。随着菌株的衰亡，部分胞内物质的溶出导致磷含量在第32h略有上升。
51.在以高浓度硝态氮(100mg/l)为底物的反硝化除磷过程中(图3b)，菌株接种后第8 h进入对数期，第24h进入稳定期。菌株能以no
3-‑
n为唯一氮源进行生长繁殖，同时吸收po
43-‑
p。其中，最大no
3-‑
n去除速率为10.43mg n/(l/h)，最大po
43-‑
p去除速率为0.86 mg p/(l/h)。在第24h，no
3-‑
n去除率达到最大值99％；第28h，po
43-‑
p的去除率达到最大值87％。另外，no
3-‑
n的降解过程中几乎没有nh
4+-n的累积，no
2-‑
n略有上升后快速降至0。随着菌株的衰亡，部分胞内物质的溶出导致氨氮和磷的浓度略有上升。
52.实施例4
53.铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa sndp-01利用混合氮源进行同步硝化反硝化除磷时的生长和脱氮除磷特性。
54.接种3ml的菌悬液至含300ml液体硝化反硝化培养基i和硝化反硝化培养基ⅱ的锥形瓶中，置于气浴摇床(30℃，120rpm)中培养32h，每隔4h测定nh
4+-n、no
2-‑
n和no
3-‑
n、 po
43-‑
p的浓度和od
600
值。
55.在以氨氮和亚硝态氮为混合氮源的硝化反硝化除磷过程中(图4a)，菌株接种后的第8 h进入对数期，第24h进入稳定期，菌株在生长的同时分解无机氮源底物并吸收磷酸盐。其中，nh
4+-n、no
2-‑
n、po
43-‑
p的最大去除速率分别为5.34mg n/(l/h)、5.74mg n/(l/h)、 0.82mg p/(l/h)。在第20h，nh
4+-n的去除率达到最大值96％；在第28h，po
43-‑
p的去除率达到最大值99％；第32h，no
2-‑
n的去除率达到100％。而在以氨氮和硝态氮为混合氮源的硝化反硝化除磷过程中(图4b)，菌株的生长性能及污染物去除性能与以氨氮和亚硝态氮为底物的过程相似。其中，nh
4+-n、no
3-‑
n、po
43-‑
p的最大去除速率分别为3.90mgn/(l/h)、3.58mg n/(l/h)、1.15mg p/(l/h)。在第16h，nh
4+-n的去除率达到最大值96％；在第32h，no
3-‑
n和po
43-‑
p的去除率分别达到最大值99％和96％。另外，同步硝化反硝化脱氮过程中几乎没有中间产物的积累。随着菌株的衰亡，部分胞内物质的溶出导致氮磷含量在第28h略有上升。
56.实施例5
57.铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa sndp-01在实际生活废水中的污染物去除性能。
58.接种3ml的菌悬液至含300ml生活废水的锥形瓶中，置于气浴摇床(30℃，120rpm) 中培养32h，每隔4h测定nh
4+-n、no
2-‑
n和no
3-‑
n、po
43-‑
p的浓度。
59.结果见图5所示。铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa sndp-01接种至生活污水后，氨氮和正磷酸盐的浓度快速下降。其中，nh
4+-n和po
43-‑
p的最大去除速率分别为
6.20mgn/(l/h)和1.19mg p/(l/h)。在第16h，nh
4+-n和po
43-‑
p的去除率达到最大值99％和93％。脱氮过程几乎没有中间产物的积累。随着菌株的衰亡，自16h起，部分胞内物质的溶出导致磷含量上升。
60.实施例6
61.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01异养硝化除磷的过程中磷的分布情况及eps中磷的存在形式。
62.接种3ml菌悬液至含300ml液体硝化培养基的锥形瓶中，置于气浴摇床(30℃，120rpm) 中培养32h，第8h、16h、24h分别测定溶液中、胞内、eps、细胞膜上的总磷含量，第24h 测定存在于胞内和eps上的磷形式。
63.结果如图6所示。在好氧条件下，随着铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)sndp-01 的生长，培养基中的磷酸盐不断被菌株吸收入胞内进行细胞代谢并合成细胞膜，菌株生长到稳定期后，磷主要分布在菌株的eps和细胞膜上。另外如图7所示，eps上的磷主要以磷酸单酯的形式存在，而胞内的少量磷主要以正磷酸盐、磷酸单酯和磷酸二酯的形式存在，这与传统聚磷菌以多聚磷酸盐颗粒的形式将磷储存在胞内的方式显著不同，该种储存形式有利于磷元素的回收。
64.65.