一种鲍鱼多糖的制备方法及应用

1.本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鲍鱼多糖的制备方法及应用。


背景技术：

2.近几年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖、蛋白质与核酸一样是涉及生命活动本质的三类生物大分子之一。多糖作为重要的生物活性物质，不仅是人体生命必需的成分，而且存在于一切细胞膜结构中，并参与了细胞的各种生命现象的调节，可作为免疫促进剂，能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，对肿瘤细胞起抑制作用，同时对正常细胞无毒害作用。
3.鲍鱼又名鳆、鳆鱼，是单壳软体且具有很高营养价值的海洋贝类，鲍鱼生长期长，在海洋的高盐、高压、低温这种特殊环境中生活，身体中富集了大量生理活性物质，有研究从鲍鱼中分离和纯化出能够高效抑制鼻咽癌细胞的纯多糖，现有研究也显示鲍鱼多糖具有很好的抗肿瘤活性和增强机体免疫功能。申请号为cn200510047409.x的中国专利公开了“鲍鱼多糖的提取方法”，其中，具体公开了将鲍鱼去壳取肉，用组织捣碎机破壁，加水浸提，离心分离后浓缩提取液，在利用乙醇实现醇沉，离心后真空法或喷雾法干燥得产品，在提取过程中用加碱提取、超声波提取、酶提取，酶提取可以用单一酶、双酶、复合酶、自溶酶和复合法提取的方法，该本发明开创了从鲍鱼提取鲍鱼多糖的工艺路线，有效地将鲍鱼多糖提取出来，但是利用复合酶、超声等方法提取，多糖得率较低；申请号为cn201110123164.x的中国专利公开了“鲍鱼多糖的制备工艺”，具体公开了在常温下进行高压脉冲电场处理鲍鱼预处理液，再利用壳聚糖进行絮凝提高多糖纯度，并利用电渗析进行处理脱去重金属，最后用醇沉制得鲍鱼多糖的方法，该方法在保证所得多糖的生物活性的同时，解决了传统酶法提取工艺多糖得率低的难题；但是制备过程中采用高压脉冲电场进行提取需要使用大量的有机溶剂，且得率低、不易操作、危险性大、对设备要求苛刻，无法实现产业化生产。


技术实现要素：

4.为克服现有技术中存在的问题，本发明提供及一种鲍鱼多糖的制备方法，通过分别的二次酶解和超滤的结合对冻干粉碎处理的鲍内脏粉进行处理，提取鲍鱼多糖，在简化工艺的同时能够提高传统酶解的多糖提取率。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明公开了一种鲍鱼多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
7.(1)预处理：利用冻干粉碎方法处理鲍鱼内脏，得到鲍鱼内脏粉；
8.(2)一次酶解：采用综合酶处理鲍鱼内脏粉，得到酶解液；所述综合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白；
9.(3)超滤：超滤鲍鱼内脏酶解液，将酶解液过截留分子量30kda的超滤膜，透过液再过10kda超滤膜；
10.(4)经过一次酶解和超滤过程后获得的多糖样品再次进行二次酶解和超滤，获得
鲍鱼内脏粗多糖。
11.(5)经过上述步骤制得的鲍内脏粗多糖cavp通过阴离子交换和sephacryls-300hr柱层析柱进行纯化分离，制得最终鲍鱼多糖。
12.进一步的，所述步骤(1)中鲍鱼内脏粉与综合酶解液的料液比1:20～1:60；加酶量为1000～5000u/g。
13.进一步的，所述步骤(2)中一次酶解的温度为50～60℃，ph为9.0～9.5，酶解时间为15～19h。
14.进一步的，所述步骤(4)中二次酶解采用风味蛋白酶，酶解的温度为50～60℃，ph为8.0～9.0，酶解时间为10～15h。
15.本发明还公开了依旧上述制备方法制得的鲍鱼多糖应用在鲍鱼多糖胶囊中。
16.进一步的，所述鲍鱼多糖胶囊具体包括如下重量份的原料：鲍鱼多糖、100-150份，黄芪提取物、100-120份，西洋参提取物、25-33.3份，玉米淀粉、80-92.7份和硬脂酸镁、2-4份。
17.相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明提供的鲍鱼多糖制备方法中，鲍鱼内脏经过一次酶解、超滤和二次酶解、超滤的过程处理后制得鲍鱼多糖，其中利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白构成的综合酶进行鲍鱼内脏的一次酶解后，多糖提取率较低，为13.59％，超滤截留后酶解液中蛋白质含量为36.37％：经过二次酶解后，多糖的提取率为51.75％，蛋白质含量为20.51％，达到了较好的粗多糖脱蛋白效果，最后经过分离纯化后，鲍鱼内脏多糖中有甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡糖糖、木糖和岩藻糖等。
附图说明
18.图1为依据本发明实施例1至3制备的鲍鱼多糖内单糖的成分测试示意图；
19.图2为依据本发明实施例1至3制得的鲍鱼多糖的红外扫描光谱图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
21.实施例1
22.一种鲍鱼多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
23.(1)预处理：利用冻干粉碎方法处理鲍鱼内脏，得到鲍鱼内脏粉；经过冻干粉碎处理的鲍内脏粉原料中各成分含量见表1；
24.表1原料基本成分分析
[0025][0026]
(2)一次酶解：采用综合酶处理鲍鱼内脏粉，得到酶解液；所述综合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白；其中，一次酶解的温度为50℃，ph为9.5，酶解时间为19h，鲍鱼内脏粉与综合酶解液的加入比例为1:40，加酶量为3000u/g；经过
一次酶解后，多糖的提取率为13.59％，蛋白质水解率为37.18％；
[0027]
(3)超滤：超滤鲍鱼内脏酶解液，将酶解液过截留分子量30kda的超滤膜，透过液再过10kda超滤膜；经测试，各酶解液中蛋白质浓度均在1mg/ml条件下，分子量大于30kda的酶解液对dpph清除率最低，而分子量在10kda与30kda之间的酶解液对dpph清除率较高，选择10kda超滤膜对鲍内脏酶解液进行超滤分离；
[0028]
(4)经过一次酶解和超滤过程后获得的多糖样品再次进行二次酶解和超滤，获得鲍鱼内脏粗多糖，二次酶解采用风味蛋白酶，酶解的温度为50℃，ph为9.0，酶解时间为10h；
[0029]
(5)经过上述步骤制得的鲍内脏粗多糖cavp通过阴离子交换和sephacryls-300hr柱层析柱进行纯化分离，制得最终鲍鱼多糖。
[0030]
实施例2
[0031]
一种鲍鱼多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
[0032]
(1)预处理：利用冻干粉碎方法处理鲍鱼内脏，得到鲍鱼内脏粉；；经过冻干粉碎处理的鲍内脏粉原料中各成分含量参见表1；
[0033]
(2)一次酶解：采用综合酶处理鲍鱼内脏粉，得到酶解液；所述综合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白；其中，一次酶解的温度为60℃，ph为9.0，酶解时间为15h，鲍鱼内脏粉与综合酶解液的加入比例为1:60，加酶量为1000u/g；经过一次酶解后，多糖的提取率为11.64％，蛋白质水解率为35.31％；
[0034]
(3)超滤：超滤鲍鱼内脏酶解液，将酶解液过截留分子量30kda的超滤膜，透过液再过10kda超滤膜；
[0035]
(4)经过一次酶解和超滤过程后获得的多糖样品再次进行二次酶解和超滤，获得鲍鱼内脏粗多糖，二次酶解采用风味蛋白酶，酶解的温度为60℃，ph为8.0，酶解时间为15h；
[0036]
(5)经过上述步骤制得的鲍内脏粗多糖cavp通过阴离子交换和sephacryls-300hr柱层析柱进行纯化分离，制得最终鲍鱼多糖。
[0037]
实施例3
[0038]
一种鲍鱼多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
[0039]
(1)预处理：利用冻干粉碎方法处理鲍鱼内脏，得到鲍鱼内脏粉；经过冻干粉碎处理的鲍内脏粉原料中各成分含量参见表1；
[0040]
(2)一次酶解：采用综合酶处理鲍鱼内脏粉，得到酶解液；所述综合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白；其中，一次酶解的温度为55℃，ph为9.2，酶解时间为18h，鲍鱼内脏粉与综合酶解液的加入比例为1:20，加酶量为5000u/g；经过一次酶解后，多糖的提取率为12.51％，蛋白质水解率为34.02％；
[0041]
(3)超滤：超滤鲍鱼内脏酶解液，将酶解液过截留分子量30kda的超滤膜，透过液再过10kda超滤膜；
[0042]
(4)经过一次酶解和超滤过程后获得的多糖样品再次进行二次酶解和超滤，获得鲍鱼内脏粗多糖，二次酶解采用风味蛋白酶，酶解的温度为55℃，ph为8.5，酶解时间为12h；
[0043]
(5)经过上述步骤制得的鲍内脏粗多糖cavp通过阴离子交换和sephacryls-300hr柱层析柱进行纯化分离，制得最终鲍鱼多糖。
[0044]
性能测试：
[0045]
(1)理化性质检测
[0046]
对经过实施例1至3制得的鲍鱼多糖的理化性质进行检测，具体结果如下表2；表,2本发明制得的鲍鱼多糖的理化性质。
[0047][0048]
(2)成分及含量检测
[0049]
参见图1和表3，为依据实施例1(图1a)制得的鲍鱼多糖中中单糖比例最高的是半乳糖；实施例2(图1b)制得的鲍鱼多糖中氨基葡萄糖和半乳糖含量较高；实施例3(图1c)制得的鲍鱼多糖中主要为氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖，含量接近；各多糖组分均含有带氨基基团的单糖，实施例1、实施例2和实施例3中氨基糖类分别占16.15％、45.35％、24.24％；
[0050]
表3鲍鱼多糖样品的单糖组成
[0051][0052]
依据本发明实施例1至3制得的鲍鱼多糖的红外扫描光谱，其中，图2a为依据实施例1制得的鲍鱼多糖的红外扫描光谱，其中，在3200～3600cm-1
有一个较宽较强的吸收峰，是糖类-oh的伸缩振动吸收峰，同时在2923cm-1
处有一个较弱的吸收峰，是糖类c-h官能团的伸缩振动，这两组峰共同印证avp1是糖类物质，此外在1625cm-1
处的强吸收峰是乙酰氨基或者羧基c＝o的伸缩振动，1258cm-1
处为s＝o的伸缩振动，表明鲍鱼多糖中含有硫酸根，1067cm-1
吸收峰表明糖苷键为吡喃型；
[0053]
图2a为依据实施例2制得的鲍鱼多糖的红外扫描光谱，其中，在3200～3600cm-1
波长间有一个-oh宽且强的吸收峰，在2935cm-1
处的吸收为c-h的伸缩振动，同样可说明该样品为糖类物质，但是在-oh吸收峰的较低波数处(3266cm-1
)有一明显的肩缝，是氨基n-h的伸缩振动，这说明鲍鱼多糖中含有较多氨基基团，1628cm-1
处的吸收峰为乙酰氨基上或羧基c＝o的伸缩振动，1380cm-1
的吸收峰是羧基中c＝o的对称伸缩振动，与1628cm-1
共同表明鲍鱼多糖含有羧酸根，1000～1200cm-1
处的吸收峰说明该糖为吡喃型；
[0054]
图2a为依据实施例2制得的鲍鱼多糖的红外扫描光谱，其中，大致吸收峰类型与依据实施例1制得的鲍鱼多糖相似，但是区别于实施例1制得的鲍鱼多糖的，依据实施例3制得的鲍鱼多糖中的3200～3600cm-1
的吸收峰较实施例1制得的鲍鱼多糖的宽，且在吸收峰右下侧的较低波数处有一点点不明显的肩峰，判断应该是氨基n-h的伸缩振动，但可证明其氨基含量较少，因此吸收较不明显，另外依据实施例3制得的鲍鱼多糖中1253cm-1
处的吸收峰为s
＝o的特征伸缩振动，该峰型大小较实施例1制得的鲍鱼多糖的小且大于实施例2制得的鲍鱼多糖在该处的吸收，该结果同化学法比较三种多糖的硫酸根含量结果相一致。
[0055]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。